本发明专利技术公开了一种氨基酸脱氢酶及其应用，对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。本发明专利技术通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis的苯丙氨酸脱氢酶的分子改造，使其底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同时拉近了底物与辅酶之间的距离，使其获得对大位阻底物的催化活性，拓展了其催化功能用于生物合成系列具有大位阻疏水侧链的非天然氨基酸。
【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸脱氢酶及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种氨基酸脱氢酶及其应用。
技术介绍
手性氨基酸，包括天然氨基酸和非天然氨基酸，是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化学品的关键中间体。例如，D-苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素的重要中间体，作为氨苄青霉素、匹夫氨苄等的重要侧链，市场前景广阔。高苯丙氨酸(L-Homophenylalanine)，即(S)-2-氨基-4-苯基丁酸是一种非天然的手性α-氨基酸，该氨基酸是20种全球已上市的抗高血压药物血管紧张素抑制剂普利类药物，例如贝那普利、西拉普利、赖若普利、依那普利、地那普利及卡托普利等用于治疗高血压和各种心血管疾病的血管紧张素转换酶抑制剂普利类药物合成的共同手性中间体，作为常见的结构单元起着中心药效基团的作用。年需求量约1000吨且逐年递增。制备大位阻非天然氨基酸主要通过化学合成法和酶催化法。化学合成法存在诸多不足，反应过程复杂；反应条件苛刻；生成成本高；环境污染严重等。酶催化法具有高立体选择性，生产过程简单，反应安全等优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氨基酸脱氢酶。本专利技术的另一目的在于提供上述氨基酸脱氢酶的应用。本专利技术的技术方案如下：一种氨基酸脱氢酶，对如SEQIDNO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.02所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第57位的L突变为E所用的引物为L57E-F和L57E-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.03和04所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中，将第60位的G突变为S所用的引物为G60S-F和G60S-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.05和06所示，将第60位的G突变为T所用的引物为G60T-F和G60T-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.07和08所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第76位的K突变为S所用的引物为K76S-F和K76S-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.09和10所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第285位的Y突变为L所用的引物为Y285L-F和Y285L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.11和12所示，将第285位的Y突变为M所用的引物为Y285M-F和Y285M-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.13和14所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第288位的N突变为E所用的引物为N288E-F和N288E-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.15和16所示进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第333位的M突变为D所用的引物为M333D-F和M333D-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.17和18所示，将第333位的M突变为R所用的引物为M333R-F和M333R-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.19和20所示。本专利技术的另一技术方案如下：上述氨基酸脱氢酶在催化制备非天然氨基酸中的应用。在本专利技术的一个优选实施方案中，构建反应体系，于10-70℃且100-300rpm的转速震荡反应10-100h，获得所述非天然氨基酸；上述反应体系包括如下：以pH＝8-10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液为溶剂，其中含有：0.001-1mol/L酮酸或酮酸酯，0.2-500mM/LNADH，助溶剂，1-300mg/L的所述氨基酸脱氢酶。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过对获得自海洋菌株Bacillusnanhaiensis(CGMCCNO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶的分子改造，使其底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同时拉近了底物与辅酶之间的距离，使其获得对大位阻底物的催化活性，拓展了其催化功能用于生物合成系列具有大位阻疏水侧链的非天然氨基酸。2、本专利技术操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备非天然氨基酸领域具有较好的工业应用前景。附图说明图1苯丙氨酸脱氢酶基因单点突变电泳图。图2部分苯丙氨酸脱氢酶基因单点突变SDS-PAGE电泳图。图3苯丙氨酸脱氢酶部分基因组合突变电泳图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1：构建单点突变(G60S)的氨基酸脱氢酶突变体，对60位氨基酸进行突变，具体步骤如下：(1)引入突变：根据SEQIDNO.02所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(SEQIDNO.05)：G60S-FGTGCTGAGATTGTCAAAATCAATG下游引物(SEQIDNO.06)：G60S-RTGATTTTGACAATCTCAGCACATC将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD-Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物，如图1所示。(2)粗酶液的制备：构建可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株：苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)基因的原始序列来自Bacillusnanhaiensis，如SEQIDNO.01所示；根据上述原始序列和所示的上下游引物，采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coliBL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a。重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mLLB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母浸膏，10g/LNaCl。培养条件为：起始pH7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH＝7)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：/n将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。/n
【技术特征摘要】
1.一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：对如SEQIDNO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：
将第57位的L突变为E、第60位的G突变为S或T、将第76位的K突变为S、将第285位的Y突变为L或M、将第288位的N突变为E和将第333位的M突变为D或R。
2.如权利要求1所述的一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.02所示。
3.如权利要求2所述的一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中将第57位的L突变为E所用的引物为L57E-F和L57E-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.03和04所示。
4.如权利要求2所述的一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中，将第60位的G突变为S所用的引物为G60S-F和G60S-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.05和06所示，将第60位的G突变为T所用的引物为G60T-F和G60T-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.07和08所示。
5.如权利要求2所述的一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中将第76位的K突变为S所用的引物为K76S-F和K76S-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.09和10所示。
6.如权利要求2所述的一种氨基酸脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中将...
【专利技术属性】
技术研发人员：王世珍，刘凯泷，韩雨珑，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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