一种胺脱氢酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胺脱氢酶及其应用，对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M和将第333位的M突变为D。本发明专利技术的胺脱氢酶的催化反应操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备手性胺和海洋生物资源高值化开发领域具有较好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种胺脱氢酶及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种胺脱氢酶及其应用。
技术介绍
手性胺是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工手性砌块。约40％的光学活性药物含有手性胺结构。手性胺高效制备技术是手性药物领域发展的关键技术。现有技术中，手性胺的化学制备方法主要包括氨基酸或其衍生物的还原、醛或酮与亚胺的偶合以及环氧化合物的氨基化开环等，这些化学制备方法的催化效率较低且容易造成环境污染。因此，高效生物催化是解决手性胺制造并减少环境污染等问题的重要途径。生物法制备手性胺主要通过酶催化拆分或不对称还原实现，现有技术中用于制备手性胺的酶主要包括脂肪酶、转胺酶和氧化还原酶。而胺脱氢酶催化酮和氨基供体不对称还原胺化制备手性胺简洁高效而且易实现辅酶再生。苯丙氨酸脱氢酶催化天然氨基酸苯丙氨酸的氧化脱氨或还原氨化。然而对于系列酮的还原胺化制备手性胺的基本没有催化活性。通过定点突变对野生型酶进行改造，获得胺脱氢酶，提高其催化还原胺化的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种胺脱氢酶。本专利技术的另一目的在于提供上述胺脱氢酶的应用。本专利技术的技术方案如下：一种胺脱氢酶，对如SEQIDNO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M和将第333位的M突变为D。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述突变为将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M或将第333位的M突变为D。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.02所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中，将第131位的G突变为L所用的引物为G131L-F和G131L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.03和04所示，将第131位的G突变为M所用的引物为G131M-F和G131M-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.05和06所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第262位的N突变为V所用的引物为N262V-F和N262V-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.07和08所示，将第262位的N突变为L所用的引物为N262L-F和N262L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.09和10所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第285位的Y突变为L所用的引物为Y285L-F和Y285L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.11和12所示，将第285位的Y突变为M所用的引物为Y285M-F和Y285M-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.13和14所示。进一步优选的，所述突变通过PCR进行，其中将第333位的M突变为D所用的引物为M333D-F和M333D-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.15和16所示。本专利技术的另一技术方案如下：上述胺脱氢酶在催化不对称还原胺化得到手性胺中的应用。该应用的反应式如下：在本专利技术的一个优选实施方案中，构建反应体系，于10-70℃且100-300rpm的转速震荡反应10-90h，获得所述手性胺；上述反应体系包括如下：pH＝8-12，0.001-0.05mol/L酮，0.002-0.2mol/L氨基供体，0-0.2mol/L辅助底物，0.01-0.2mol/L的缓冲液，5-300mg/L的所述胺脱氢酶；上述酮的结构式为其中，R1为是C2-10的烷基、芳香基或羟基，R2为是C2-10的烷基、芳香基或羟基。进一步优选的，所述氨基供体为丙氨酸、氨水、NH4Cl和NH4NO3中的至少一种，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、碳酸钠缓冲液和磷酸钾缓冲液中的至少一种，所述辅助底物为NADH。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过氨基酸脱氢酶突变获得的新型胺脱氢酶，对R型的选择性更好；且对底物酮催化偏好与现有的酶不同，其对芳香酮以及分子式为CxHyO(其中x为4-7，y为8-14，酮的分子量为72-115)的脂肪族酮具有较好的催化活性和选择性；该胺脱氢酶的获得及其催化特性的挖掘拓展了不对称还原制备手性胺的范围。2、本专利技术的胺脱氢酶的催化反应操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备手性胺和海洋生物资源高值化开发领域具有较好的工业应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1中涉及的1，3-二甲基丁胺标准样品衍生后色谱图。(S)-1，3-二甲基丁胺和(R)-1，3-二甲基丁胺的保留时间分别为11.515min和11.617min。图2为本专利技术实施例2中涉及的5-甲基-2-己酮、5-甲基-2-己胺色谱图。底物5-甲基-2-己酮的保留时间为8.658min，(S)-5-甲基-2-己胺和(R)-5-甲基-2-己胺的保留时间分别为14.529min和14.665min。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1构建单点突变(G131L)的氨基酸脱氢酶突变体，对131位氨基酸进行突变，具体步骤如下：(1)引入突变：根据SEQIDNO.02所示的核苷酸序列设计引物，设计包含有不同位点的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物如下：上游引物(SEQIDNO.03)：G131L-Faattgtatcgtcctcgtacccgaa下游引物(SEQIDNO.04)：g131L-Rgaggacgatacaattcgtttcttt将引物和模板质粒混合后，加入高保真taq聚合酶KOD-Plus，进行全质粒PcR扩增，PcR结束后电泳检测PcR产物。(2)构建可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株：苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)基因的原始序列来自Bacillusnanhaiensis，如SEQIDNO.02所示，原始氨基酸序列如SEQIDNO.01所示；根据上述原始序列，设计如SEQIDNO.03和SEQIDNO.04所示的引物，采用PcR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PcR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PcR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pEt-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pEt28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coliBL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的胺脱氢酶的重组表达菌株E.coliBL21(DE3)/pEt28a。(3)重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pEt28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mLLB培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胺脱氢酶，其特征在于：对如SEQ ID NO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：/n将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M和将第333位的M突变为N。/n

【技术特征摘要】
1.一种胺脱氢酶，其特征在于：对如SEQIDNO.01所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，上述突变包括如下至少之一：
将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M和将第333位的M突变为N。


2.如权利要求1所述的一种胺脱氢酶，其特征在于：所述突变为将第131位的G突变为L或M、将第262位的N突变为V或L、将第285位的Y突变为L或M或将第333位的M突变为N。


3.如权利要求1或2所述的一种胺脱氢酶，其特征在于：所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.02所示。


4.如权利要求3所述的一种胺脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中，将第131位的G突变为L所用的引物为G131L-F和G131L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.03和04所示，将第131位的G突变为M所用的引物为G131M-F和G131M-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.05和06所示。


5.如权利要求3所述的一种胺脱氢酶，其特征在于：所述突变通过PCR进行，其中将第262位的N突变为V所用的引物为N262V-F和N262V-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.07和08所示，将第262位的N突变为L所用的引物为N262L-F和N262L-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.09和10所示。


6.如权利要求3所述的一种胺脱氢酶，其特征在于：所述突变通...

【专利技术属性】
技术研发人员：王世珍，霍鹤宇，韩雨珑，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35