一种生物技术领域的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的突变基因及编码蛋白；所述纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因的碱基序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：３、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：５、ＳＥＱＩＤ?ＮＯ：７、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：９、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１１、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１３或ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１５所示；所述纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因编码的蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：４、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：６、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：８、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１０、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１２、ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１４或ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１６所示；本发明专利技术还涉及一种包含前述突变基因的重组载体。通过同源重组将该本发明专利技术的突变引入野生菌株后，可获得低产氨且发生长速度不变的基因工程菌，从而生产出无氨味纳豆。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
的基因及编码蛋白，具体是一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的突变基因及编码蛋白。
技术介绍
纳豆芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Natto)是日本纳豆的发酵菌，发酵后能产生 多种独特的保健功效成份，例如纳豆激酶、多聚谷氨酸、维生素K2等，纳豆激酶已被证实具 有良好的溶解血栓功能，且无毒副作用。另外，纳豆还具有预防骨质疏松、抗氧化、抗菌、调 节肠胃等生理预防和调节功能。除预防骨质疏松与大豆本身含有的异黄酮有关外，其他功 能主要取决于发酵后产生的新物质。日本人将每年的7月10日定为纳豆节。但纳豆在中 国市场却难觅身影，究其原因，主要是发酵过程中产氨，氨在产品中累积使其风味让国人难 以接受。然而，当今世界，食疗越来越受到人们的认可和追捧，治未病的思想也开始成为各 国政府对于国民健康的主导政策。因此作为一种功能性食品，如果能改良其风味，纳豆一定 会有极大的市场需求。纳豆芽孢杆菌氨基酸代谢产氨主要是联合脱氨基作用，GDH为纳豆 菌代谢产氨途径中的关键酶。Shigeki Kada 等 在〈〈Bioscience，Biotechnology and Biochemistry))(生 物科学、生物技术和生物化学)2008年第72卷第7期1869 1876页发表了题为 《Identification of TwoMajor Ammonia-Releasing Reactions Involved in Secondary Natto Fermentation》(纳豆二次发酵过程中与氨还原释放相关的两个关键酶的鉴定)一 文，认为GDH和尿素酶是产氨的关键酶，GDH编码基因敲除后氨的含量可降低50%左右，若 将编码尿素酶的基因同时敲除，几乎可完全抑制产氨。BORIS R.BELITSKY等在《Journal of Bacterology》(细菌学杂志)1998年第180卷第23期6298 6305页发表了题为《Role and Regulation of Bacillussubtilis Glutamate Dehydrogenase Genes))(枯草芽抱杆 菌谷氨酸脱氢酶基因的作用和调节)一文，文中研究结果表明，如果敲除编码GDH的基因， 菌种的生长速度会下降，在普通的营养肉汤培养基中，代增时间由36min增加到52min。因 此如果仅仅通过敲除GDH编码基因来达到减少产氨量的目的，会付出发酵时间延长及底物 要求更高的代价。所以通过研究GDH的活性位点，利用定点突变技术获得不同GDH酶活的 突变体，进而获得具有不同GDH酶活的发酵菌株，有可能达到在不影响发酵周期的前提下， 减少产氨量，改善纳豆风味。纳豆芽孢杆菌GDH完全失活虽然可以降低产氨量，但同时延长了发酵周期，增加 了对底物的要求，因此有必要对此酶进行结构改造。经对现有技术的文献检索发现，尚未见与本专利技术的主题有关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶 基因的突变基因及编码蛋白。通过同源重组将该本专利技术的突变引入野生菌株后，可获得低产氨且发生长速度不变的基因工程菌，从而生产出无氨味纳豆。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因，该突变基因的碱基序列如 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ IDNO 13 或 SEQ ID NO 15 所示。本专利技术还涉及一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的突变基因的编码蛋白，所述 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID N0:14 或 SEQ ID NO :16 所示。本专利技术还涉及一种重组载体，该重组载体包含前述的突变基因。所述重组载体使用的载体为pET_28a。本专利技术确定了纳豆芽孢杆菌的GDH的三维结构，利用SAMM分子模拟分析等软件分 析了 GDH的活性位点和突变方案，利用QuikChange定点突变试剂盒对活性位点进行定点突 变，得到7个突变体。通过同源重组将该突变引入野生菌株后，可获得低产氨且发生长速度 不变的基因工程菌，从而生产出无氨味纳豆。本专利技术涉及的纳豆芽孢杆菌具体为纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto) SJTU 1-4 CGMCCN0 2801，已于2008年12月9日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)保藏，该单位的地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编， 10010附图说明图1模型min的拉式图检验结果；图2谷氨酸脱氢酶的三维模型；图3酶活性中心氢键结构的模拟；图4氨基酸残基化学修饰对酶活性影响的分析；图5突变质粒转化子菌落PCR产物电泳分析；图 6 GDH 表达的 SDS-PAGE 分析；图7纯化蛋白的SDS-PAGE分析；图8野生型和突变型谷氨酸脱氢酶活性的比较。具体实施例方式以下对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等著的《分子克隆实 验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按 照制造厂商所建议的条件。实施例步骤一，纳豆芽孢杆菌⑶H的同源建模；首先在PDB中搜寻与⑶H蛋白质(SEQ ID NO 2)序列的高度相似的蛋白质序列，在Swiss model上尝试性建模，经PrOsa2003残基能 量图分析后，最后选择了来自强烈炽热球菌的IGTM蛋白，嗜温球菌的IEUZ蛋白作为同源建模的模版，建模，利用SAMM分子模拟分析软件对得到的蛋白模型进行优化；具体过程如下利用NCBI的BLASTn对得到的纳豆芽孢杆菌⑶H编码基因序列(SEQ ID NO 1)进 行比对分析，使用ORF Finder模块搜寻序列中可能的开放式阅读框，并将所找到的一个含 有422个氨基酸残基的蛋白质在BLASTp中进行比对分析；在PDB中得到六段与该蛋白质序列的高度相似的蛋白质序列(相似度在50%左 右)，分别为1GTM、IEUZ, 1PZ0、1HWY、1V9L和2RIR。以前五个蛋白质序列作为模版，在Swiss mode 1上得到蛋白模型mode 11，经PrOsa2003残基能量图分析后，来自强烈炽热球菌的IGTM 蛋白，嗜温球菌的IEUZ蛋白与modell的残基能量变化趋势最为接近。选取IEUZUGTiHt 为同源建模的模版，在Swiss model上再一次建模得到蛋白模型swiss ；Swiss Model 和 PredictProtein 在 Swiss model 中使用 IGTM 禾Π IEUZ 作为模版， 按默认设置进行同源建模，在PredictProtein中，按默认设置对纳豆枯草芽孢杆菌⑶H的 二级结构特点进行逐一分析；步骤二，纳豆芽本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因，其特征在于，该突变基因的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５所示。
【技术特征摘要】
一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因，其特征在于，该突变基因的碱基序列如SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15所示。2.—种权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的突变基因编码的蛋 白质，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建华，陈丽丽，王家乐，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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