抗谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术将链球菌ＧＤＨ基因的抗原性和疏水性进行分析，去除信号肽和跨膜区域后设计一对引物对ＧＤＨ基因进行克隆，以大肠杆菌成功表达了ＷＣ－ＳＳ７的ＧＤＨ蛋白，将纯化的ＧＤＨ重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，获得了能和ＧＤＨ蛋白反应的能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３３４３；所获得的重组ＧＤＨ蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究，为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础。本发明专利技术对于进一步研究谷氨酸脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用，以及建立猪链球菌检测方法等方面有重要的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体，尤其涉及抗谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白单克隆抗体及其制 备方法，本专利技术还涉及抗GDH蛋白单克隆抗体在诊断或防治猪链球菌中的应用，属于猪链 球菌病的诊断或防治领域。
技术介绍
猪链球菌(Str印tococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原体，猪群对此病普 遍易感，感染后可有急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等多种临床类 型，如不及时治疗死亡率可达40%甚至更高；耐过的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。人类 感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡。猪链球菌的种类 繁多，到1995年已鉴定出35个荚膜血清型(1 34型及1/2型)，其中1/2、1、2、7、9型分 离频率较高，其类型的分布具有明显的地理差异。不同型甚至同一型的不同分离株致病性 也有很大差异，这与其毒力因子密切相关。由猪链球菌引发的猪链球菌病在所有养猪业发 达的国家均有报道，在我国的危害也日益加大。就世界范围来说，猪链球菌2型是最流行的 一种血清型，也是普遍认为致病性最强的一种血清型。近年来，猪链球菌在我国很多省区时 有流行或暴发，对集约化养猪造成重大损失，在本专利技术人实验室近年分离的猪链球菌中发 现有一株血清型7型的猪链球菌比分离到的1型2型9型致病力强，故本专利技术人针对这一 菌株展开相应的研究。猪链球菌病在我国被列为二类法定传染病。传统的病原分离镜检、生化试验和玻 片凝集试验是目前世界各国普查及贸易检疫最常用的方法。病原分离镜检、生化试验和玻 片凝集试验操作简单，实验条件要求不高，是我国目前主要采用的检疫方法，但结果判定主 观性较强，不易量化，易发生漏检或假阳性。上述技术诊断抗原均直接采用猪链球菌菌体本 身或提取物培养物，生产与制备过程涉及活菌培养，存在一定的生物安全危险，必须采取严 格的生物安全措施，大大提高了生产制备成本；同时，菌体抗原组成复杂，与其他种属细菌 存在一定的抗原性交叉，导致假阳性发生。利用生物技术研制安全廉价、敏感特异、能够替 代细菌培养物的重组蛋白抗原，具有重要意义。⑶H蛋白是猪链球菌的谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，⑶H)，是连接碳 代谢和氮代谢的一个关键酶，是细菌能量代谢过程中的一个十分重要的功能分子，对细菌 致病性有着重要意义，GDH存在于所有的猪链球菌菌株中，也是Okmima bua等于2001年发 现的一个与SS2毒力相关的因子，GDH蛋白在抗原性上具有较好的猪链球菌种属特异性。 猪链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族，其氨基酸序列与存在于各个物种中的谷氨酸 脱氢酶蛋白(GDH)的序列相似，都包括保守基序和典型的GDHl型家族的功能区域，在细胞 表面表达，酶活性是NAD (P)H依赖型的，作用底物为L-谷氨酸，其编码基因在SS2中保守存 在。有研究表明，SS2的GDH有保守的抗原性，能与感染有猪链球菌的猪的血清反应，可作 为检测猪链球菌的重要标志性抗原，基于GDH蛋白的检测可区分SS2的强毒株、弱毒株和无 毒株。有试验证明将GDH表达的产物进行酶活性测定，结果表明猪链球菌的GDH是NADP (H)特异性酶，它能利用NADPH作辅酶催化α -酮戊二酸合成L-谷氨酸，且活性较高，而催化 谷氨酸生成 α-酮戊二酸的活性较弱(Benachenhou-Lahfa N, Forterre P, Labedan B.Evolution of glutamatedehydrogenase genes :evidence for two paralogous proteinfami lies and un-usual branching patterns of thearchaebacteria in the universal tree of life [J]. MolEvol，1993，36 :335_346.)。总之，目前国内外对 GDH 的研 究都是仅针对SS2的报导。猪链球菌导致猪患疫病，并可感染人患脑膜炎和败血症，甚至引起死亡，在世界许 多国家均受到重视。猪链球菌病传播快、潜伏期短、死亡率高，故快速和准确地对该菌进行 分型对于该病的诊断、治疗、预防及流行病学调查等方面有重要意义。但由于该菌类型多 样，毒力因子复杂不一，且各毒力因子的致病机理和相互作用与关系仍未明确，对该病的诊 断和防治仍缺乏有效手段，现有 的各种检测方法尚不能满足临床需求，因此如何建立快速 和准确的分型方法有待继续探究。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供能够分泌抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体的杂 交瘤细胞系；本专利技术目的之二是提供由上述杂交瘤细胞系所分泌的抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶 蛋白单克隆抗体；本专利技术目的之三是将上述抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体应用于诊断 或防治猪链球菌病；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的⑶H基因克隆入表达载体pET_30a，转入 大肠杆菌中，用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，在约为52Ku处可见 一条明显的诱导表达带，说明⑶H蛋白得到了正确的表达；用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化 的GDH蛋白免疫BALB/c小鼠，取鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合通过间接ELISA方法筛 选阳性克隆，细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选，最终得到了能和GDH蛋 白反应的能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞系(IODl)，其微生物保藏号是CGMCCNo. 3343 ；分 类命名猪链球菌(Sti^ptococcus suis)；保藏时间是2009年10月19日；保藏单位中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科 学院微生物研究所。本专利技术进一步对上述杂交瘤细胞系所分泌的抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克 隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定。这些单抗通过Western鉴定结果显示其具有良好的特 异性，单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgGl型，且轻链均为k链。本专利技术将链球菌GDH基因的抗原性和疏水性进行分析，去除信号肽和跨膜区域后 设计一对引物对GDH基因进行克隆，以大肠杆菌表达、纯化的GDH重组蛋白免疫BALB/c小 鼠，制备单克隆抗体，为研究猪链球菌7型的GDH蛋白功能和检测猪链球菌血清特异抗体诊 断方法的建立奠定基础。本专利技术首次对于猪链球菌7型⑶H进行研究报导。本试验想通过对SS7的⑶H的 研究比较与SS2的⑶H的异同点，结果显示WC-SS7的⑶H基因序列与Gene-Bank里公布的⑶H AY853916相应序列同源性达98%。说明不同血清型之间还有一定的差异，但⑶H基因的在链球菌种中具有保守性，可作为诊断性抗原应用，并且本试验纯化的GDH蛋白检测现 地猪血清的猪链球菌抗体的方法已建立并进行了初步应用，结果显示特异性良好。本专利技术将链球菌GDH基因的抗原性和疏水性进行分析，去除信号肽和跨膜区域后 设计一对引物对GDH基因进行克隆，以大肠杆菌表达、纯化的GDH重组蛋白免疫BALB/c小 鼠，制备单克隆抗体。本专利技术成功表达了 WC-SS7的GDH蛋白，并获得了能和GDH蛋白反应 的能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞系，所获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
分泌抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于：其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３３４３。

【技术特征摘要】
分泌抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于其微生物保藏号是CGMCC No.3343。2.权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌的单...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑杰，蔡雪辉，徐敏，武佳斌，刘永刚，石文达，李丽琴，徐明明，荣福龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]