一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术根据丁酸梭状芽孢杆菌核心基因设计特异性引物，将特异性引物用于丁酸梭状芽孢杆菌的筛选和鉴定。与基于TSN选择性培养基的传统筛选方法相比，本发明专利技术提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌PCR方法，准确度高，准确率可达100％；特异性强；灵敏度高，检出限为7.95×10

A highly efficient method for identification / screening of Clostridium butyricum and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用
本专利技术涉及一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用，属于微生物

技术介绍
丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)，又名酪酸梭菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种革兰氏阳性厌氧细菌。广泛存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便及土壤中。丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程中产气,发酵产物包括乙酸、丁酸、丁醇、淀粉酶、脂肪酶、维生素等。丁酸梭状芽孢杆菌作为微生态制剂的研究是1933年日本千叶医学院博士首先发现并报告。此后,丁酸梭状芽孢杆菌由于可调节人体肠道微生态平衡，具有极强的整肠作用等益生功能，被广泛用作肠炎治疗药物、食品添加剂、兽药和饲料添加剂。因此，筛选大量不同来源的丁酸梭状芽孢杆菌，构建丁酸梭状芽孢杆菌资源库，对于挖掘我国益生菌的资源、选择具有优良益生特性的丁酸梭状芽孢杆菌用于治疗和缓解人类疾病意义重大。丁酸梭状芽孢杆菌作为厌氧菌，主要从粪便和土壤中筛选，目前，普遍采用RCM以及TSN琼脂培养基进行筛选，最后分离株通过生理生化实验及16SrRNA测序进行鉴定。然而RCM琼脂培养基特异性差，同时丁酸梭状芽孢杆菌不是肠道和土壤中的优势菌株，其相对丰度低导致最终筛选较为困难。TSN琼脂培养基特异性较RCM琼脂培养基高，但由于丁酸梭状芽孢杆菌在样本中分布不均一，特别是粪便样本，含有丁酸梭状芽孢杆菌的样本比例低，工作量大且不易获得目标菌株这使得丁酸梭状芽孢杆菌的筛选和分离具有偶然性和随机性，工作量大且不易获得目标菌株，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。因而发展高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所述高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是通过设计丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物，凝胶电泳检测PCR扩增结果来确定粪便样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌，缩小筛选样品的范围来进行的。本专利技术的第一个目的是提供一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以(a)～(c)任一所示的引物对微生物进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特异性条带的为丁酸梭状芽孢杆菌；其中，(a)正向引物：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇(SEQIDNO:1)；反向引物：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇(SEQIDNO:2)；(b)正向引物：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇(SEQIDNO:3)；反向引物：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇(SEQIDNO:4)；(c)正向引物：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇(SEQIDNO:5)；反向引物：5＇-CACCTAAATCGGCAGCAGCAT-3＇(SEQIDNO:6)。本专利技术的第二个目的是提供一种筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以所述(a)～(c)任一所示的引物对样品进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特定大小特异性条带的样品含有丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(a)所示的引物进行PCR扩增，并获得1022bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(b)所示的引物进行PCR扩增，并获得491bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述方法采用(c)所示的引物进行PCR扩增，并获得445bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。在一种实施方式中，用于所述PCR扩增的反应体系中含有DNA模板、2×TaqPlusMasterMix(Dye)、正向引物、反向引物和无菌双蒸水的体积比为4:25:1:1:19。在一种实施方式中，DNA模板的终浓度为10-20ng/μL。在一种实施方式中，PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。本专利技术还要求保护所述方法在微生物
筛选或鉴定丁酸梭状芽孢杆菌方面的应用。在一种实施方式中，所述方法采用选择性培养基培养样品中的微生物，挑取单菌落，以单菌落或其DNA为模板进行PCR扩增；所述选择性培养基含有：酵母粉、蛋白胨、亚硫酸钠、柠檬酸铁、新霉素和多粘菌素B。在一种实施方式中，所述选择性培养基为TSN培养基，每L含有：酵母粉10g，蛋白胨15g，亚硫酸钠1g，柠檬酸铁0.5g，新霉素0.05g，多粘菌素B0.02g，琼脂粉20g。有益效果：(1)准确度高、特异性强本专利技术提供的丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物具有高度特异性，在本专利技术涉及的丁酸梭菌菌株内，准确率达100％。可以特异性检测出丁酸梭状芽孢杆菌，所检测的阴性对照如索氏梭菌(Clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、第三梭菌(Clostridiumtertium)、近端梭菌(Clostridiumsubterminale)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(Clostridiumbarati)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、Clostridiumsulfidigenes、Clostridiumaerotolerans和水对照均无阳性结果。(2)灵敏度高，检测结果准确使用传统筛选方法筛选丁酸梭状芽孢杆菌，对样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌是未知的，导致筛选的盲目性、工作量大。本专利技术提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物具有灵敏度高的特点，最小检出限为103CFU/μL。即使样品中丁酸梭状芽孢杆菌含量低或已经失活，使用本专利技术的PCR扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定，为筛选样品指明了方向，加快了实验进程，提高了筛选效率。(3)耗时少，迅速获得结果传统筛选丁酸梭状芽孢杆菌方法具有盲目性、随机性，筛选周期长、工作量大。一个样品筛选周期为4-5天。分离得到的菌株经16SrRNA鉴定将耗时2-3天才能得到准确结果。本专利技术通过一次特定的PCR扩增即可完成粪便样品的筛选，缩小筛选样品范围，减少了约90％不含丁酸梭状芽孢杆菌样品不必要的筛选工作。同时，分离得到的菌株可以经16SrRNA鉴定，也可以通过本专利技术提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物进行鉴定，从PCR扩增到琼脂糖凝胶电泳检测判定只需要4-5个小时。利用本专利技术提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，在时间成本、工作量、经济成本等方面具有明显的优势。附图说明图1为实施例2中特异性引物CBU21F/CBU1023R对20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，其特征在于，以(a)～(c)任一所示的引物对微生物进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特异性条带的为丁酸梭状芽孢杆菌；其中，/n(a)正向引物：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇；/n反向引物：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇；/n(b)正向引物：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇；/n反向引物：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇；/n(c)正向引物：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇；/n反向引物：5＇-CACCTAAATCGGCAGCAGCAT-3＇。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，其特征在于，以(a)～(c)任一所示的引物对微生物进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特异性条带的为丁酸梭状芽孢杆菌；其中，
(a)正向引物：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇；
反向引物：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇；
(b)正向引物：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇；
反向引物：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇；
(c)正向引物：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇；
反向引物：5＇-CACCTAAATCGGCAGCAGCAT-3＇。


2.一种筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，其特征在于，以(a)～(c)任一所示的引物对样品进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特定大小特异性条带的样品含有丁酸梭状芽孢杆菌；其中，
(a)正向引物：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇；
反向引物：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇；
(b)正向引物：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇；
反向引物：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇；
(c)正向引物：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇；
反向引物：5＇-CACCTAAATCGGCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，陆文伟，易至，翟齐啸，崔树茂，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32