本发明专利技术公开了一种哈维氏弧菌（VHV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到300fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。
【技术实现步骤摘要】
哈维氏弧菌(VHV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种哈维氏弧菌的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
哈维氏弧菌(Vibrioharveyi，VHV)是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于海洋环境中，是引起多种水产养殖动物特别是海水鱼类流行性疾病的一种重要病原弧菌，引发水产动物皮肤溃烂、肌体出血和大批死亡。已曾经在世界范围内引起海水养殖虾类疾病，也引起海水养殖鱼类的流行性疾病爆发，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。目前，哈维氏弧菌的致病机理尚不十分清楚，主要检测手段有：生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术等。但这些方法存在一些缺点和不足：生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰、rRNA基因在物种中非常保守，使得技术特异性不强。目前的PCR虽然是一种具有灵敏度高、特异性强的靶DNA快速检测方法，样品中含有少量的致病因子就能检出。然而PCR检测技术方法较为繁琐，耗时长。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供哈维氏弧菌(VHV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种哈维氏弧菌(VHV)核酸的检测试剂盒，包括：哈维氏弧菌正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述哈维氏弧菌正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述哈维氏弧菌反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、哈维氏弧菌标准品和ddH2O中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，哈维氏弧菌标准品为含有哈维氏弧菌保守区溶血素vhhA基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有哈维氏弧菌保守区溶血素vhhA基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种哈维氏弧菌的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在哈维氏弧菌的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述哈维氏弧菌正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述哈维氏弧菌反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环。本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为哈维氏弧菌阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为哈维氏弧菌阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝。2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和。3、高特异性：本专利技术对鱼其他的病症鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)的DNA均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到300fg/反应。5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对VHV的灵敏度实验图，从左到右依次为300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL的阳性标准品的扩增结果。图3为RAA检测方法对VHV的特异性实验图。具体实施方法以下通过具体实施例对本专利技术进一步说明，但并不局限于此。实施例1：本专利技术对哈维氏弧菌在Genebank数据库中搜索哈维氏弧菌溶血素vhhA基因序列，使用DNAMAN6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。表1引物和探针序列：由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种哈维氏弧菌（VHV）核酸的检测试剂盒，包括：哈维氏弧菌正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述哈维氏弧菌正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述哈维氏弧菌反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n
【技术特征摘要】
1.一种哈维氏弧菌（VHV）核酸的检测试剂盒，包括：哈维氏弧菌正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述哈维氏弧菌正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述哈维氏弧菌反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、哈维氏弧菌标准品和ddH2O中至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。
5.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，钱冬，曹志，黄震巨，张建勋，肖文，余国君，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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