一种沙门菌的四重荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种沙门菌的四重荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒，具体是一种肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的四重荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒，本发明专利技术的方法和试剂盒具有快速、简单、特异性强、灵敏度高、适合现场检测的优点，具有广阔的市场前景，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门菌的四重荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的四重荧光定量PCR引物组、包括该引物组四重荧光PCR检测方法以及包括该引物组的四重PCR检测试剂盒。
技术介绍
随着规模化养禽业的快速发展，疫病的发生和流行也相应增加，导致养禽业经济效益下降。沙门菌是一大群寄生于人类和动物肠道内的革兰阴性菌，是常见的人畜共患型致病菌，目前已报道的血清型超过2500种。其中，肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌可感染家禽并给带来严重的经济损失。另外，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等可通过鸡蛋、鸡肉进入人类食物链，已成为各国引起人食物中毒致死亡的重要病原，给食品安全带来隐患。国内外对细菌性疾病的诊断和监测技术种类繁多，主要包括：细菌分离培养及生化鉴定、分子生物学技术、免疫学技术等。传统细菌的检测方法通常需要先分离再培养细菌，不仅操作繁琐、耗时长、而且容易污染。另外，沙门菌血清型的鉴定主要是通过血清凝集试验、生化鉴定等传统方法，但是存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等缺点；鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的抗原结构相似，通过传统方法难以区分血清型。在血清型鉴定过程中，不同操作人员的判定标准不完全一致，因此结果的稳定性、重复性及灵敏性非常差。许多快速、灵敏的分子生物学方法已被应用于细菌的检测、鉴定，克服了传统检测方法的缺陷，常规PCR技术应用于病原菌的检测有着较为良好的效果。但是常规PCR方法存在特异性低的缺陷，复杂样品中的某些成分对PCR扩增存在抑制作用，扩增时容易产生假阳性。另外，常规PCR方法需通过凝胶电泳判定结果，操作较为复杂，并且存在交叉污染问题。而荧光定量PCR采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，并且灵敏性显著高于普通PCR方法。但是在多重荧光PCR在同一反应管中同时检测多个目标基因时，不同引物及探针之间存在相互干扰。因此，需要优化引物浓度、探针浓度、最佳反应条件等因素，才能建立特异性强、灵敏度高的多重荧光PCR方法。因此，迫切需要一种高效、快速的检测方法用于区分鉴定家禽常见的沙门菌，对疫病有效防控意义重大。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的荧光定量引物组，其特征在于，包括：特异性扩增肠炎沙门菌lygD基因的引物对lygD-F、lygD-R和探针lygD-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGP-F、SGP-R和探针SGP-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SG-F、SG-R和探针SG-P；特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对SAT-F、SAT-R和探针SAT-P，各个引物的核苷酸序列分别为：lygD-F，5’-TCTGGGACGCCAAAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)lygD-R，5’-TGACGGTAGATTGTGTCTCAAAGC-3’，(SEQIDNO.2)lygD-P，5’-TCAAACTTACTCAGGAGATCGCCGCTG-3’：(SEQIDNO.3)探针lygD-P的报告基团为CY5、淬灭基团为BHQ-2；SGP-F，5’-GGATGTCCACGCTCATTTCTC-3’，(SEQIDNO.4)SGP-R，5’-TGAAAGCTGGCGTTACGGTTA-3’，(SEQIDNO.5)SGP-P，5’-CGTCAGGCCCACCGCCGACAG-3’；(SEQIDNO.6)探针SGP-P的报告基团为FAM、淬灭基团为BHQ-1；SG-F，5’-CAGGCGATCATATCTACAAGCAGG-3’，(SEQIDNO.7)SG-R，5’-TCTTGTCGCTTTCATCGACCGC-3’，(SEQIDNO.8)SG-P，5’-ACTCGCGTATGTTTTGAAAAGGGC-3’；(SEQIDNO.9)探针SG-P的报告基团为JOE、淬灭基团为BHQ-1；SAT-F，5’-GTTCAGCTCCGGTAAAGAGAA-3’，(SEQIDNO.10)SAT-R，5’-AGCAGCGGCACTACATATTC-3’，(SEQIDNO.11)SAT-P，5’-CGTTTGAGTGCCTGGTCTATCTGCA-3’(SEQIDNO.12)探针SAT-P的报告基团为CY3、淬灭基团为BHQ-2；本专利技术的另一个目的是提供一种基于TaqMan探针法的四重荧光PCR检测试剂盒，用于检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌，其特征在于，包括：用于建立PCR反应体系的2×PremixExTaq(ProbeqPCR)预混液和引物组。本专利技术提供的四重荧光PCR检测试剂盒，还具有这样的特征：其中，2×PremixExTaq(ProbeqPCR)的体积10μL，在引物组中，引物对lygD-F和lygD-R的体积各为0.2μL，探针lygD-P的体积为0.1μL，引物对SGP-F和SGP-R的体积各为0.1μL，探针SGP-P的体积为0.1μL，引物对SG-F和SG-R的体积各为0.2μL，探针SG-P的体积为0.1μL，引物对SAT-F和SAT-R的体积各为0.4μL，探针SAT-P的体积为0.8μL。本专利技术的再一个目的是提供一种基于Taqman探针法检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的四重荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于待检测细菌制备得到DNA模板；步骤2，制备特异性引物探针组；步骤3，进行荧光定量PCR扩增反应，基于步骤1得到的DNA模板，采用步骤2得到的特异性引物探针组建立反应体系，然后采用该反应体系在预定反应参数条件下进行荧光定量PCR；步骤4，根据荧光定量PCR扩增曲线判定是否出现肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌。本专利技术提供的四重荧光PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤1中PCR模板为待检测细菌的DNA，制备方法为：将待检测细菌的菌株接种至LB液体培养基，在温度为37℃的条件下培养至OD600＝1.0，得到菌液，然后将该菌液按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒中的说明书进行基因组DNA的提取。本专利技术提供的四重荧光PCR检测方法，还具有这样的特征：制备特异性引物探针组时，引物组中使用的各个引物探针的浓度为10μM，将使用的各个引物的稀释液置于-20℃保存后再用。本专利技术提供的四重荧光PCR检测方法，还具有这样的特征：预定荧光定量PCR反应参数条件为95℃预变性30s；95℃5s，57℃40s，40次循环。本专利技术提供的四重荧光PCR检测方法，还具有这样的特征：步骤4的具体过程为，观察是否有特征性S曲线，当检测到C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的荧光定量引物组，其特征在于，包括：特异性扩增肠炎沙门菌lygD基因的引物对lygD-F、lygD-R和探针lygD-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGP-F、SGP-R和探针SGP-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SG-F、SG-R和探针SG-P；特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对SAT-F、SAT-R和探针SAT-P，/n各个引物的核苷酸序列分别为：/nlygD-F，5’-TCTGGGACGCCAAAAAGC-3’，(SEQ ID NO.1)/nlygD-R，5’-TGACGGTAGATTGTGTCTCAAAGC-3’，(SEQ ID NO.2)/nlygD-P，5’-TCAAACTTACTCAGGAGATCGCCGCTG-3’；(SEQ ID NO.3)/n探针lygD-P的报告基团为CY5、淬灭基团为BHQ-2；/nSGP-F，5’-GGATGTCCACGCTCATTTCTC-3’，(SEQ ID NO.4)/nSGP-R，5’-TGAAAGCTGGCGTTACGGTTA-3’，(SEQ ID NO.5)/nSGP-P，5’-CGTCAGGCCCACCGCCGACAG-3’；(SEQ ID NO.6)/n探针SGP-P的报告基团为FAM、淬灭基团为BHQ-1；/nSG-F，5’-CAGGCGATCATATCTACAAGCAGG-3’，(SEQ ID NO.7)/nSG-R，5’-TCTTGTCGCTTTCATCGACCGC-3’，(SEQ ID NO.8)/nSG-P，5’-ACTCGCGTATGTTTTGAAAAGGGC-3’；(SEQ ID NO.9)/n探针SG-P的报告基团为JOE、淬灭基团为BHQ-1；/nSAT-F，5’-GTTCAGCTCCGGTAAAGAGAA-3’，(SEQ ID NO.10)/nSAT-R，5’-AGCAGCGGCACTACATATTC-3’，(SEQ ID NO.11)/nSAT-P，5’-CGTTTGAGTGCCTGGTCTATCTGCA-3’；(SEQ ID NO.12)探针SAT-P的报告基团为CY3、淬灭基团为BHQ-2。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的荧光定量引物组，其特征在于，包括：特异性扩增肠炎沙门菌lygD基因的引物对lygD-F、lygD-R和探针lygD-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGP-F、SGP-R和探针SGP-P；特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SG-F、SG-R和探针SG-P；特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对SAT-F、SAT-R和探针SAT-P，
各个引物的核苷酸序列分别为：
lygD-F，5’-TCTGGGACGCCAAAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)
lygD-R，5’-TGACGGTAGATTGTGTCTCAAAGC-3’，(SEQIDNO.2)
lygD-P，5’-TCAAACTTACTCAGGAGATCGCCGCTG-3’；(SEQIDNO.3)
探针lygD-P的报告基团为CY5、淬灭基团为BHQ-2；
SGP-F，5’-GGATGTCCACGCTCATTTCTC-3’，(SEQIDNO.4)
SGP-R，5’-TGAAAGCTGGCGTTACGGTTA-3’，(SEQIDNO.5)
SGP-P，5’-CGTCAGGCCCACCGCCGACAG-3’；(SEQIDNO.6)
探针SGP-P的报告基团为FAM、淬灭基团为BHQ-1；
SG-F，5’-CAGGCGATCATATCTACAAGCAGG-3’，(SEQIDNO.7)
SG-R，5’-TCTTGTCGCTTTCATCGACCGC-3’，(SEQIDNO.8)
SG-P，5’-ACTCGCGTATGTTTTGAAAAGGGC-3’；(SEQIDNO.9)
探针SG-P的报告基团为JOE、淬灭基团为BHQ-1；
SAT-F，5’-GTTCAGCTCCGGTAAAGAGAA-3’，(SEQIDNO.10)
SAT-R，5’-AGCAGCGGCACTACATATTC-3’，(SEQIDNO.11)
SAT-P，5’-CGTTTGAGTGCCTGGTCTATCTGCA-3’；(SEQIDNO.12)探针SAT-P的报告基团为CY3、淬灭基团为BHQ-2。


2.一种肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：用于建立PCR反应体系的2×PremixExTaq(ProbeqPCR)预混液和引物组。


3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少辉，于圣青，信素华，梁华，李涛，田明星，祁晶晶，丁铲，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31