维生素B制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B

Vitamin B

【技术实现步骤摘要】
维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针
本专利技术涉及生物
，尤其涉及维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针。
技术介绍
维生素B2又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。为体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，导致多种疾病，是生命活动不可缺少的维生素。对于人和动物来说，必须从食物中获取维生素B2。人体每天大约需要0.3-1.8mg维生素B2，而动物饲料中必须含有1-4mg/kg的维生素B2才能满足其生长需要并提高营养的利用率。目前维生素B2的生产途径主要采用微生物发酵法，主要使用的生产菌种有阿舒氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等，其中，枯草芽孢杆菌是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，可形成内生抗逆芽胞，无致病性，环境兼容性好，而且还具有良好的发酵基础等优点被作为最常用的生产菌株。由于天然菌株合成维生素B2的生产效率低，对其进行基因改造缩短发酵周期、提高维生素B2的产量是常用的方法，但是基因工程菌在构建过程中，通常需要引入外源抗性基因作为筛选标记。转基因菌株在产品中的残留可能会使人和动物产生致病性、致癌、致突变；且其携带的抗性基因可能会在环境中转移导致人和动物对抗生素等药物产生抗性；转基因微生物或质粒上携带的抗药性基因也有可能通过基因转移而使得其他与人类和动物关系密切的致病性微生物获得该基因；另外，转基因微生物的转移也会对生态环境造成不利影响。活菌残留检测是一种对产品质量及安全性评估的有效方法，可以有效预防转基因微生物的转移对人、动物和生态环境造成危害。因此，对维生素B2产品中进行GMB.subtilis活菌及孢子进行残留检测是非常必要的，要严格控制微生物发酵产品的质量，保护产品的安全性和使用安全性。常用的细菌活菌检测方法为平板培养法、代谢产物检测法、信使RNA法，但是这类方法只能检测活菌，不能特异性鉴别某一种菌株的残留，此外，有关孢子检测方面的内容很少。因此灵敏度高、特异性强、高通量和定量准确的实时荧光定量PCR技术被广泛应用于定性、定量检测致病菌、DNA残留等。人们常用16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌，但是该方法操作繁琐，对转基因菌株的鉴别具有局限性，且枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的16SrRNA基因相似度达到99％以上，无法用该方法进行区分，因此我们采用GMB.subtilis菌株的特有序列设计出qPCR的引物和探针，可特异性鉴别生产菌株的残留。
技术实现思路
本专利技术针对维生素B2产品中GMB.subtilis生产菌株活菌及孢子残留的检测开发了一种新的方法，该方法结合了选择性平板培养法和实时荧光定量PCR法。具体方法为在平板培养法的基础进行优化，采用氯霉素最低选择压力培养基排除杂菌的影响，且延长培养时间促使应激细胞恢复，能特异性检测生产菌株，且由于枯草芽孢杆菌是内生芽孢型菌株，对其进行孢子检测也是非常有必要的。为了排除抗性菌株的影响，进一步鉴别生产菌株的残留是必要的，采用qPCR方法特异性验证抗性平板中的菌株是否为GMB.subtilis生产菌株。本专利技术相对于传统的平板培养法，能消除杂菌的影响；相对于16SrRNA基因序列分析法而言，本专利技术所使用的引物和探针是根据GMB.subtilis特有的序列设计的，能特异性测定生产菌株活菌及孢子残留，且在实际样品测试中具有高的稳定性和特异性。本专利技术提供了维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针，能有效检测维生素B2中生产菌株(GMB.subtilis)的残留活菌及孢子并判断维生素B2产品质量是否安全。本专利技术提供的技术方案为一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilisKCCM-10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGAGCTTTTGCGCGTATA-3’，其反向引物为5’-GCCATTCCAATACAAAACCACATA-3’。一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测探针，探针序列为FAM-CGGATCTAACGCATGCTCCGCA-BBQ。一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，包括所述的引物、所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。而且，qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；PCR反应体系中含有12.5μL2xTaqTM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。而且，鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留的方法为，往含有不同氯霉素浓度的平板计数培养基中加入的活化菌液，进行培养，且延长培养时间促进细菌生产，同时以生产菌株作为阳性对照，确定能抑制样品杂菌生长的最低氯霉素浓度即为氯霉素最小选择压力，再采用抗性平板计数培养基鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留。而且，检测平板培养基上的菌为活菌的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。而且，检测平板培养基上的菌为孢子的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；60℃条件下热处理30min，诱导枯草芽孢杆菌的芽孢萌发；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：本专利技术能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GMB.subtilis生产菌株残留活菌及孢子，并开发了一种检测所涉及的引物、探针及检测方法。该方法结合了平板培养法和qPCR法的优势，能特异性检测GMB.subtilis活菌及孢子残留，而且不会存在杂菌干扰、假阳性的结果。附图说明图1为生产菌株的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1是Marker，泳道2是生产菌株基因组DNA；图2为通过琼脂糖凝胶电泳分析qPCR产物，1是Marker，其中最下方条带代表100bp，2、3和4泳道是扩增不同浓度基因组DNA的qPCR产物；图3为qPCR产物的序列；图4为批号H201606004FM样品中活产菌株的检测。A:维生素B2活菌平板98％；B：活菌检测阳性对照板；C：活菌检测阴性对照板。图5为批号H201804004FM样品中活产菌株的检测。D：维生素B280％制剂活菌检测板；E：活菌检测阳性对照板；F：活菌检测阴性对照板。图6为批号H201606004FM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种维生素B

【技术特征摘要】
1.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilisKCCM-10445，其特征在于引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGAGCTTTTGCGCGTATA-3’，其反向引物为5’-GCCATTCCAATACAAAACCACATA-3’。


2.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测探针，其特征在于：探针序列为FAM-CGGATCTAACGCATGCTCCGCA-BBQ。


3.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：包括权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。


4.根据权利要求3所述的维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；PCR反应体系中含有12.5μL2xTaqTM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10m...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢正东，肖其磊，陈情，尹露露，付强，雷华，
申请(专利权)人：湖北广济药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42