用于检测细菌污染的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于检测细菌污染的组合物、反应混合物、试剂盒和系统，及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测细菌污染的方法和组合物本申请是2014年07月23日提交的专利技术名称为“用于检测细菌污染的方法和组合物”的第201480041899.X号(国际申请号PCT/US2014/047914)中国专利申请的分案申请。交叉引用本申请要求2014年7月25日提交的美国临时申请号61/858,495的权益，该申请通过引用全文并入本文。专利技术背景移植组织和输血制品的微生物污染是重要的医学问题。血库面临在释放每个血小板袋以输注到患者体内前检测其微生物污染的巨大挑战。该挑战的一部分与血小板样品相对较短的贮藏期(通常5-7天并且有时更短)有关。标准储存条件使关于血小板的挑战进一步复杂化。与大多数其他的可移植组织不同，血小板不能耐受冷冻，并且如果经受即使非常短时间的冷却，血小板也会从接受者的循环中迅速消失。这种对血小板存活的冷却效应被认为是不可逆的，并且使得血小板不适合于输血。当血小板暴露于低于20℃的温度时，它们迅速经历指示损伤的形状改变。在输血前保持血小板在室温(例如，22-25℃)下的需求已导致了针对血小板储存的一套独特的昂贵且复杂的物流需求。由于血小板在室温下是代谢活性的，因此它们通常在气体可透过的容器中经受恒定的搅拌以允许气体交换，从而防止代谢性酸中毒的毒性后果。这些储存条件促进细菌的生长，从而造成细菌感染的更高风险。由于依赖于培养检测的筛选方法可能花费比可用贮藏期更长的时间来检测污染，因此污染的血小板经常被输注至患者体内，而随后在培养结果变得可获得时医师才得知血小板已被污染。在美国血库协会(AmericanAssociationofBloodBanks)(A.A.B.B.)标准5.1.5.1下，要求血库或输血机构采用有关方法来限制和检测在所有血小板浓缩物中的细菌污染。然而，用细菌污染的血小板输血的风险可能高达千分之一，且可能这些事件的10％-25％对患者产生不利影响。尽管一些污染可能来源于供体菌血症，但在收集时由皮肤上或血包中存在的细菌引起的污染是无法通过供体诊断筛选而解决的污染的主要来源。减轻污染的常用方法包括预防措施(例如，手臂清洗、转移采集的血液的第一部分以及过滤)和培养方法。如由目前的污染速度所证明的，这些程序仍然是不充分的。而且，由于基于培养的检测方法需要大量的温育时间(有时数天)，因此样品可能在其有效寿命的大部分时间中不能使用，并且当样品被使用时，检测可能没有完成。对于由相对缓慢生长的细菌引起的污染尤其如此。例如，使用标准的培养方法，已估计得到芽孢杆菌属的种(Bacillussp.)、葡萄球菌属的种(Staphylococcalsp.)、链球菌属的种(Streptococcalsp.)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、变异库克菌(Kocuriavarians)、棒状杆菌属的种(Corynebacteriumsp.)和丙酸杆菌属的种(Propionibacteriumsp.)的平均检测时间分别为24小时、27小时、34小时、47小时、56小时、87小时和97小时。一种可商购的试验被称为BacT/ALERT试验(bioMérieux，Inc.，Durham，N.C.)。细菌检测基于增殖细菌的二氧化碳释放。在培养瓶底部的二氧化碳敏感的液体乳液传感器改变颜色并通过传感器上所反射的光的改变而进行检测。用于细菌检测的另一种方法涉及测量血小板制备样品中的氧气含量。一个实例是PalleBDS试验(PallCorporation，PortWashington，N.Y.)。用于检测的方法将样品袋内空气的氧气含量测量为细菌的替代标志物。使用氧气分析仪来测量具有血小板的袋或包的顶部空间气体中氧气的百分比。如果在采集的血小板样品中存在细菌，则温育期间通过样品中细菌的代谢活性和增殖将消耗增加量的氧气，导致血浆以及样品袋内的空气的氧气含量的可测量减少。尽管细菌生长的非特异性测量允许检测许多种细菌，但其灵敏度相对较低并且需要较长的温育时间。标准的基于培养的筛选的替代方法包括细菌抗原检测和基于核酸的筛选。基于抗原的方法的主要限制是它们无法直接应用于检测细菌病原体谱未知的样品。已经提出常见细菌核酸序列如16SrRNA的检测来实现更广谱的检测，但这类方法目前被认为灵敏度和特异性低于当前的培养方法并且不适合于血小板样品的早期检测。
技术实现思路
本公开内容提供了用于检测生物样品如血小板样品的污染的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和系统，其既具有宽范围又具有高检测特异性和灵敏度。根据本公开内容的污染检测还显著快于基于培养的筛选方法。在一个方面，本公开内容提供了检测样品的细菌污染的方法，该细菌污染由多种细菌物种如至少八种细菌物种中的任何物种所引起。在一个实施方案中，该方法包括：在单个反应混合物中，使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800、700、600、500、400、300、200、150或100个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应，所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针，其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼，所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列，并且所述保守序列在至少八种细菌物种中是相同的；以及检测所述探针与所述扩增子的杂交，其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号，该可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的样品的细菌污染。在一些实施方案中，所述样品是血液样品或血沉棕黄层样品，并且所述污染是受试者的脓毒症的预测或诊断。在一些实施方案中，所述样品是血小板样品。在一些实施方案中，所述血小板样品是通过单采术分离的血小板浓缩物。在一些实施方案中，使从少于5mL的血小板浓缩物中分离的核酸经历核酸扩增反应。在一些实施方案中，所述扩增子由细菌16SrRNA多核苷酸模板产生。在一些实施方案中，所述细菌污染的检测在向接受者输注之前完成。在一些实施方案中，所述扩增反应产生可检测量的不超过300个碱基或不超过150个碱基的扩增子。在一些实施方案中，所述扩增反应产生可检测量的100-200个碱基的扩增子。在一些实施方案中，所有的细菌物种均为使用具有不同的可检测标记物的探针在同一反应中检测到的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、或两者的组合。在一些实施方案中，所述至少八种细菌物种包括多种革兰氏阳性菌种和多种革兰氏阴性菌种。在一些实施方案中，所述细菌物种选自：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、金黄色葡萄球菌Mu3(StaphylococcusaureusMu3)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、嗜酸乳杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测由至少八种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法，其包括：/n在单个反应混合物中，使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应，所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针，其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼，所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列，并且所述保守序列在所述至少八种细菌物种中是相同的；以及/n检测所述探针与所述扩增子的杂交，其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号，所述可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的所述血小板样品的细菌污染。/n

【技术特征摘要】
20130725 US 61/858,4951.一种检测由至少八种细菌物种中的任何物种引起的血小板样品的细菌污染的方法，其包括：
在单个反应混合物中，使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应，所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针，其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼，所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列，并且所述保守序列在所述至少八种细菌物种中是相同的；以及
检测所述探针与所述扩增子的杂交，其中由所述探针进行的杂交产生可检测信号，所述可检测信号指示由所述至少八种细菌物种中的任何物种引起的所述血小板样品的细菌污染。


2.一种检测血小板样品的细菌污染的方法，其包括：
在单个反应混合物中，使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应，所述反应混合物包含单个引物对和单种可检测探针，其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼，所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列，并且所述样品或其一部分在扩增前没有在35℃以上的温度下进行培养；以及
检测所述探针与所述扩增子的杂交，其中由所述探针进行的杂交产生指示所述血小板样品的细菌污染的可检测信号。


3.一种在获得血小板样品后24小时内快速检测该血小板样品的细菌污染的方法，其包括：
在单个反应混合物中采用单个引物对和单种可检测探针，使所述样品或其一部分在产生可检测量的不超过约800个碱基的扩增子的条件下经历核酸扩增反应，其中所述引物对位于所述扩增子的侧翼，所述扩增子包含与所述可检测探针杂交的保守序列，并且来自任一种物种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)；以及
在获得所述样品后约24小时内，检测所述探针与所述扩增子的杂交，其中由所述探针进行的所述杂交产生指示所述血小板样品的细菌污染的可检测信号，由此在获得所述样品后约24小时内检测所述污染。


4.一种检测受试者的生物样品中由来自不同属的多种细菌物种中的任何物种引起的细菌污染的方法，其包括：
用单个引物对对所述样品或其一部分进行核酸扩增反应，以产生可检测量的、16SrRNA多核苷酸的不超过约800个碱基的扩增子，其中来自所述物种中的任一种的约1pg-5pgDNA的扩增具有小于30的循环阈值(CT)；以及
采用一种或多种可检测探针检测所述扩增子，其中所述一种或多种可检测探针中的每一种均与保守序列特异性杂交，并且所述保守序列在来自不同属的多种细菌物种中是相同的。


5.一种用于扩增和检测16SrRNA多核苷酸的一部分的组合物，所述部分的长度小于约800个核苷酸，所述组合物包含：
第一引物，其包含如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建全，崔相民，陈晓岚，
申请(专利权)人：德诚分子诊断，
类型：发明
国别省市：美国;US