一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，包括特异性引物对及包含该引物对的试剂盒，其中试剂盒包括试剂一、试剂二和封闭剂；试剂一包含引物FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；试剂二包含Tris‑HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween‑20和甜菜碱，pH 8.8。本发明专利技术提供的试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，不仅适合现场灵敏监测检测，以及大人流、快速通关背景下的现场检疫查验检测需求，也适合实验室快速检测。

A kit for rapid detection of Yersinia pestis

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒。
技术介绍
鼠疫(plague)，由鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)引起，是一种广泛流行于鼠类和其他野生啮齿动物中的自然疫源性烈性传染病，具有发病急剧、传染性强、传播速度快、病死率高等特点，易酿成流行甚至大流行。根据感染途径的不同，鼠疫主要可分为腺鼠疫、肺鼠疫、败血型鼠疫和肠鼠疫等。在我国，鼠疫自然疫源地的鼠间鼠疫还一直存在，人间鼠疫仅在一些个别地区有少数散发病例。国内外首次报告了从自然感染鼠疫的病死藏系绵羊体内分离出鼠疫耶尔森菌，并有多起关于以染疫藏羊为传染源的人间鼠疫流行的记录。自20世纪90年代以来，我国鼠疫又开始活跃，西北旱獭疫源地的人、动物鼠疫仍连年不断，南方家鼠鼠疫和北方沙鼠鼠疫双双暴发流行，在局部地区的黄鼠鼠疫依然存在，人间病例明显回升，新的疫源县不断增加，疫源地面积迅速扩大，对疫区内人群的生产和生活构成了严重的威胁。我国鼠疫流行除了自然感染发生外，就是人为的感染扩张。据世界卫生组织报告，2017年8月起非洲马达加斯加共和国暴发鼠疫疫情，2017年8月1日-10月30日，全国报告鼠疫疑似病例1801例，死亡病例127例，病死率(CFR)7％。其中，1111例(62％)为肺鼠疫，261例(15％)为腺鼠疫，1例为败血症型鼠疫，其余428例未分型(尚待进一步分型中)。(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs267/en/)。据世卫组织统计，该国每年均有鼠疫疫情暴发，暴发期一般为每年9月至第二年4月，往年均以腺鼠疫病例为主，但今年鼠疫的流行时间提前，暴发的疫情以最致命的肺鼠疫病例为主，且影响范围既有传统流行地区也有非流行地区，首次暴发于以往的非流行区和人口密集的沿海地区，包括首都安塔那那利佛市(Antananarivo)和港口城市图阿马西那(Toamasina)在内的主要中心城市。鉴于鼠疫的进一步传播的风险增加以及疾病的严重性，疫情继续传播扩散的风险极高，防止鼠疫传入已成为紧迫任务。因此，提供一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，且能够实现实时快速，方便快捷，特异性强的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种快速检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒，本试剂盒采用独特的缓冲体系，具有扩增兼容性较强的优点，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增，具有敏感、快速、简便、实时检测鼠疫耶尔森菌的特点，不仅适合现场监测，以及大人流、快速通关背景下的现场查验检测需求，也适合实验室快速检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：根据鼠疫耶尔森菌F1基因序列中的保守序列(GeneBank号：X61996.1)，设计一种快速检测鼠疫耶尔森菌的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：FP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGAAC-3’；BP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCCTTGCCAATC-3’；IF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’。含有上述的特异性引物对的试剂盒。进一步的，包括试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH8.8；各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40-60pmol、IF20-30pmol、dNTP10-20mM、BsDNA聚合酶8-10U/μL、Tris-HCl20-30mM、硫酸铵10-20mM、氯化钾10-20mM、硫酸镁8-10mM、Tween-200.1％、甜菜碱0.8-1M。进一步的，所述试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；所述试剂二包含Tris-HCl，硫酸铵，氯化钾，硫酸镁，Tween-20和甜菜碱，pH8.8；各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40pmol、IF20pmol、dNTP10mM、BstDNA聚合酶8U/μL、Tris-HCl20mM，硫酸铵10mM，氯化钾10mM，硫酸镁8mM，Tween-200.1％，甜菜碱0.8M。进一步的，所述指示剂包括pH指示剂和/或荧光染料；所述pH指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂，在最终反应体系中：甲酚红0.08mM，苯酚红0.02mM。进一步地，所述封闭剂为石蜡。进一步的，在最终反应体系中，所述荧光染料为1×水溶液的SYBRGreenI或EveGreen。进一步的，所述试剂盒的灵敏度为10-1000拷贝/test；核酸浓度检测限不低于100拷贝/μL。本专利技术中试剂盒中的试剂利用一种一元包装诊断试剂瓶进行储存，其中试剂瓶设有检测管、检测管盖、放置槽和覆膜；其中，检测管为一端开口，另一端封闭的中空反应管；检测管盖与检测管相适配，覆盖在检测管的开口端，封闭检测管，其中检测管与检测管盖一体成型；检测管盖内侧设置放置槽，放置槽与检测管盖一体成型；覆膜为PPE薄膜，覆盖在放置槽上。其中，本专利技术将试剂一置于检测管盖上的放置槽内，然后利用覆膜对放置槽进行封口，并将试剂二和封闭剂放置到检测管底部，最后盖上检测管盖，完成试剂盒的组装。其中，气溶胶污染是困扰整个核酸扩增领域的难题，聚合酶螺旋反应扩增效率高，反应剧烈，也不免会产生带有大量扩增生产的核酸，将气溶胶污染封闭剂在反应前加入到反应管中，反应过程中熔化成液体覆盖反应液(包括试剂一和试剂二)，阻止了气溶胶的挥发，并且对扩增反应无影响，反应完成后会再次凝结成固体，永久封闭反应液，杜绝了产物污染。试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用Chelex裂解液，加热提取待检测样品的核酸；其中所述Chelex裂解液为5.0gChelex-100(Bio-rad)和1.0mlTritonX-100溶于100mlTE缓冲液(Tris10mM,EDTA1mM)中制成Chelex裂解液；(2)以步骤(1)所述核酸为模板加入所述试剂盒的所述试剂一中，后与所述试剂二和所述封闭液进行混合；并设置阳性和阴性对照；(3)在65-67℃的条件下，恒温扩增40-60min，显色法观察判断结果和/或利用荧光实时检测法进行检测。其中，显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在鼠疫耶尔森菌基因(阳性)，检测管颜色变为红色表示待测样本中不存在鼠疫耶尔森菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色变为红色，则本次检测结果无效，应重新检测。显色法检测原理为：当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着PSR反应的进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测鼠疫耶尔森菌的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：/nFP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGA AC-3’；SEQ ID NO.1；/nBP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCC TTGCCAATC-3’；SEQ ID NO.2；/nIF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’；SEQ ID NO.3。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鼠疫耶尔森菌的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：
FP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGAAC-3’；SEQIDNO.1；
BP：5’-AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCCTTGCCAATC-3’；SEQIDNO.2；
IF：5’-GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC-3’；SEQIDNO.3。


2.含有权利要求1所述的特异性引物对的试剂盒。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括试剂一、试剂二和封闭剂；其中试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；
试剂二包含Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、Tween-20和甜菜碱，pH8.8；
各组分在最终反应体系中的工作浓度如下：FP、BP各40-60pmol、IF20-30pmol、dNTP10-20mM、BstDNA聚合酶8-10U/μL、Tris-HCl20-30mM、硫酸铵10-20mM、氯化钾10-20mM、硫酸镁8-10mM、Tween-200.1％、甜菜碱0.8-1M。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂一包含FP、BP、IF、dNTP、BstDNA聚合酶和指示剂；
所述试剂二包含Tris-HCl，硫酸铵，氯化钾，硫酸镁，Tween-20和甜菜碱，pH8.8；
各组分在最终反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，张乔，刘丽娟，慈颖，刘威，张晓龙，杨燕，孙筱霞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11