一种人肠道菌群定量检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人肠道菌群定量检测方法及应用，人肠道菌群定量检测方法包括以下几个步骤S01、粪便样本采集、存放与标记；S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况；上述检测方法应用于检测人体粪便中菌群的含量并与健康人群各菌群参考范围进行比对，以评估人体肠道微生态的健康状况。本发明专利技术具有可有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理等优点。

A quantitative detection method of human intestinal flora and its application

【技术实现步骤摘要】
一种人肠道菌群定量检测方法及其应用
本专利技术涉及微生物检测的
，特别是一种人肠道菌群定量检测方法及应用的

技术介绍
人体肠道内存在大量共生微生物，并通过多种途径影响人体健康，尤其是各种代谢物在人体的健康促进和疾病发生、发展中起着重要作用。肠道微生态研究发现，糖尿病、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、肥胖、抑郁症等疾病均与肠道微生态相关，最新研究发现阿尔兹海默症或与肠道微生物有关，肠道微生态平衡正成为人体健康的重要标志。维持肠道微生态的动态平衡，有助于人体抵御各种疾病的干扰，保持健康状态，维持肠道微生态的平衡主要是维持肠道菌群的数量保持在稳定健康数值范围内。肠道菌群种类繁多，主要有普拉梭菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、奇异菌属、柔嫩梭菌、真杆菌、肠杆菌、酪酸梭菌、毛螺菌、阿克曼菌、弧菌等。肠杆菌(Enterobacteriaceae)，该菌科为人体肠道内正常菌群，参与人体的代谢及免疫，但该菌属，尤其是大肠杆菌，很大一部分菌为致病菌或条件致病菌，当人体免疫力低下或细菌侵入肠道以外部位时，也可引起疾病多脂饮食，会造成该菌科条件致病茵茵群增加。肠球菌(Enterococcus)，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，它不像乳酸菌一样被认为是安全可靠的，当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与肠球菌之间的共生状态失衡，肠球菌离开正常寄居部位进入其他组织器官，分泌细胞溶解素、明胶酶等毒力因子侵袭破坏宿主组织细胞，引起宿主的非特异性免疫应答。拟杆菌(Bacteroides)，参与人体多种代谢过程，部分菌株被报道具有条件致病性，易引起机体的机会性感染。该菌可调节营养吸收，粘膜免疫，外源物质代谢，及肠粘膜血管的形成及发育等。双歧杆菌(Bifidobacteria)、乳酸菌(LacticAcidBacterial，LAB)，均为益生菌，参与机体多种代谢过程，并产乳酸，以双歧杆菌为有益菌的代表，促进肠道蠕动，改善便秘，减少吲哚、亚硝酸胺等致癌物质产生，促进矿物质及维生素D的吸收和利用等，及增强机体免疫功能。同时可将人体无法吸收的胆固醇转变成粪甾醇，从粪便中排出，具有降血脂的功能等等，为人体健康的晴雨表。奇异菌属(Atopobiumcluster)从葡萄糖主要的发酵产物是乳酸，其他尚有乙酸和甲酸。产丁酸菌(ButyricAcidBacterial，BAB)，代表菌：酪酸梭菌(ClostridialclustersCGl)，柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)，直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)，普拉氏梭杆菌(F.prausnitzii)。丁酸在肠道健康方面起着十分重要的作用，一方面，为肠粘膜细胞的主要能量来源，一方面抑制肠道中的致病菌，保持肠道菌群平衡，从而预防和治疗肠道疾病方面起至决定性作用。普拉梭菌，作为肠道一种抗炎的细菌，有报道称其可以抵消克罗恩病(Crohn’sDisease)患者体内的异常免疫反应对消化道的损伤。同时，它与8种人体的代谢物质有统计相关性，参与宿主多种代谢过程。毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)能发酵葡萄糖和多种碳水化合物并产生乳酸、乙酸等，还能用来预防结肠炎等疾病。弧菌属(Vibrio)细菌种类多，分布广泛，尤以水中最为常见。引起人类疾病的主要有霍乱弧菌的古典生物型和埃尔托生物型、副溶血性弧菌，不凝集弧菌可引起霍乱样疾病或轻度腹泻。肠道菌群容易受到饮食习惯、药物、环境等因素干扰，轻微的肠道微生态失衡会导致人体的亚健康状态，也可能会进一步恶化肠道生态系统，导致疾病发生。肠道菌群用于疾病预测和健康管理仍处于初步发展阶段。中华消化杂志提供了关于肠道菌群失调的诊断治疗建议，作为临床医师参考。目前监测方法主要以直接涂片的定性分析和细菌培养的定量检查为主，耗时且难以准确判断。部分研究机构选择以16S、指纹图谱、NGS、甲烷和氢呼气法等进行正常菌群和菌群失调的早期诊断，以期发现可靠的生物标记物，操作较为繁琐，不能有效评估人体肠道健康状况及做好肠道健康管理。肠道微生物在离体后，若不能进行及时的核酸提取，会导致菌群的数量、种类及丰度发生变化，粪便是提取肠道微生物核酸的来源，因此，可通过及时分析离体粪便中菌群数量即可衡量肠道微生态健康与否。
技术实现思路
本专利技术的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种人肠道菌群定量检测方法及应用，能够有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理。为实现上述目的，本专利技术提出了一种人肠道菌群定量检测方法，包括以下几个步骤：S01、粪便样本采集、存放与标记，收集目标人群的待测粪便，取适量的粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中加入适量的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息；S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。作为优选，所述粪便样本和粪便保存液按W/V为(3～5):1的比例进行混匀。作为优选，所述PCR检测中使用的荧光物为SYBR荧光染料、Taqman探针染料或分子信标中的一种，PCR检测使用的PCR反应液由2XSYBRPCR预混液反应液、引物1、引物2和去离子水组成。作为优选，所述引物1和引物2的浓度均为0.1uM。作为优选，所述标准品组的数量为4且四个标准品组中分别加入阳性质标准品S1、S2、S3和S4。作为优选，所述阳性质标准品S1、S2、S3和S4的浓度分别为1E7、1E6、1E5、1E4拷贝/微升。作为优选，所述检测结果分析时应考虑提取过程中提取效率的影响，提取效率根据以下公式进行计算：其中，Sa计数值为标定量的内参菌株Sa所含菌数，Sa实验定量值为Y值，所述Y值由公式Y＝aX+b计算得到，其中，a为斜率，b为常数，X为PCR扩增Ct值，a、b均可通过扩增软件得到。作为优选，所述检测菌的含量由公式检测菌含量＝(10^Y)/提取效率计算得到。本专利技术还公开上述人肠道菌群定量检测方法的应用，所述人肠道菌群定量检测方法通过检测人体粪便中的普拉梭菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、奇异菌属、柔嫩梭菌、真杆菌、肠杆菌、酪酸梭菌、毛螺菌、阿克曼菌、弧菌的含量并与健康人群各菌群参考范围进行比对，以评估人体肠道微生态的健康状况。本专利技术的有益效果：本专利技术具有可有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理的优点。本专利技术的特征及优点将通过实施例进行详细说明。【具体实施方式】本专利技术一种人肠道菌群定量检测方法，包括以下几个步骤：S01、粪便样本采集、存放与标记，收集腹泻人群的待测粪便，取1g粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中并加入按粪便样本和粪便保存液按W/V为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：包括以下几个步骤：/nS01、粪便样本采集、存放与标记：收集目标人群的待测粪便，取适量的粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中加入适量的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息；/nS02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；/nS03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。/n

【技术特征摘要】
1.一种人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
S01、粪便样本采集、存放与标记：收集目标人群的待测粪便，取适量的粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中加入适量的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息；
S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；
S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。


2.如权利要求1所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述粪便样本和粪便保存液按W/V为(3～5):1的比例进行混匀。


3.如权利要求1所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述PCR检测中使用的荧光物为SYBR荧光染料、Taqman探针染料或分子信标中的一种，PCR检测使用的PCR反应液由2XSYBRPCR预混液反应液、引物1、引物2和去离子水组成。


4.如权利要求3所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述引物1和引物2的浓度均为0.1uM。


5.如权利要求3所述的人肠道菌群定...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，朱罗罗，徐威，张辉，林清源，
申请(专利权)人：杭州同创越诚基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33