从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞\类器官研究领域，公开了一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法。本发明专利技术具有以下优点和效果：通过Dispase(分散酶)降解弹性蛋白，在细胞完好的前提下使得结肠上皮层与固有层之间的连接松散，并通过在OGM培养基中添加Thiazovivin(TZV)、SB431542和CHIR99021三种小分子以提高类器官诱导成功率，能够以较低成本较高效率可靠地获取人类结肠类器官；同时具有以下优点：无需依赖高技能的上皮层剥离技术；获得更多的原代结肠祖细胞；提高原代培养基对结肠类器官的诱导成功率；利于推广与应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞\类器官研究领域，特别涉及从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法。

技术介绍

[0002]类器官(Organoids)指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维(3D)培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。类器官三维培养是一种新兴的用来研究组织成体干细胞生长、分化、器官形成的体外研究系统。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能，并能长期稳定传代培养。
[0003]结肠是人体结构和功能最复杂的器官之一，结肠上皮具有极强的自我更新能力，其更新速度在成体哺乳动物的各器官中是最快的。目前，结肠类器官的三维培养是将分离的结肠隐窝或干细胞植入含有多种生长因子的细胞外基质(ECM)中，生成具有结肠上皮样结构的微型空心球体，这些球体被称为结肠类器官。
[0004]结肠类器官模型是肠干细胞在体外构建与体内肠上皮组织密切相似的隐窝
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绒毛结构的技术突破。因此，类器官作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)人结肠隐窝的分离：无菌采集人结肠活检或手术样本，冷PBS洗涤后剪碎，转移到50mL管中，加入1mg/mL的Dispase(分散酶)进行解离后，再用100％FBS孵育，加入Advanced DMEM/F12并通过移液枪枪头上下吹吸数次，自然沉降后弃上清，用冰冷的含山梨醇和蔗糖的螯合缓冲液重悬，收集中层，即为隐窝悬液；(2)人结肠类器官的诱导培养：将步骤1所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入Advanced DMEM/F12进行洗涤，离心弃上清，重复数次后重悬计数，根据计数结果用预冷的Matrigel或BME重悬，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中，待胶完全凝固后加入预热的含生长因子的OGM培养基培养。2.根据权利要求1所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(1)中，PBS包括100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、5mM EDTA和0.1％BSA，放于4℃冰箱预冷，并在隐窝分离实验开始前准备好冰袋，结肠离体后应尽快进行取样并迅速置于含冷PBS缓冲液的15mL离心管中，取样后的运输过程需保持肠黏膜样本被冷PBS覆盖，并在冰袋上运输/保存。3.根据权利要求2所述的从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法，其特征在于：在步骤(1)中，取10cm细胞培养皿放于冰上并加入少许冷PBS，将结肠黏膜样本转移至培养皿中，用无菌一次性手术刀片在培养皿中将活检组...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞赤慧，
申请(专利权)人：杭州同创越诚基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：