一种血管化胰岛微器官及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种血管化胰岛微器官及其构建方法。该血管化胰岛微器官由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子。该血管化胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。后具备完善的血糖响应机制。后具备完善的血糖响应机制。

【技术实现步骤摘要】
一种血管化胰岛微器官及其构建方法


[0001]本专利技术属于细胞培养和微器官构建
，具体涉及一种血管化胰岛微器官及其构建方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是由遗传因素和环境因素长期共同作用导致的一种慢性、全身性代谢疾病。糖尿病是目前威胁中国人民以及全世界人民健康的重要慢性杀手之一，大部分患者从患病初期就饱受病痛折磨，并且最终会因糖尿病并发症失去生命。近年来，胰岛移植作为新兴的糖尿病治疗方法取得了一定的成功。目前对于1型糖尿病以及2型糖尿病胰岛功能衰竭的理想治疗方案只有胰岛移植。但供体胰岛的严重不足极大限制了这种方法的普及。如何打破供体的局限，获得可用于移植的功能性胰岛β细胞，一直是糖尿病治疗领域的巨大挑战。近年来，研究者们发现了胰岛类器官可能模拟胰岛分泌胰岛素这一重要功能来治疗糖尿病。胰岛类器官可通过诱导干细胞或者共培养胰腺中多种细胞得到的具有胰岛功能的器官样结构，它更接近动物及人体的分子细胞环境，在体外培养后，可以移植到人体内，起到治疗作用。
[0003]Ⅰ型糖尿病约占儿童期各型糖尿病总数的90％，是危害儿童健康的重大儿科内分泌疾病，我国近年发病率为2/10万～5/10万，5岁以下儿童发病率年平均增速5％～34％，发病呈现低龄化趋势。我们希望再生医学与免疫屏蔽相结合，通过用实验室产生的人类胰岛样细胞簇替代受损细胞，这些细胞簇可以按需产生正常量的胰岛素，从而在领域内产生真正的改变。
[0004]目前在胰岛类器官培育中还存在的一个关键问题就是尚无法建立完善的血管网络，移植后因胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足，严重影响长期疗效。人胰岛中存在十分丰富的血管网络，它们是胰岛氧气和营养物质运输、血糖感知、激素分泌的重要途径，是胰岛调控血糖稳态的关键。另外，目前的胰岛类器官虽然在体外具备糖刺激的胰岛素分泌能力，但是其响应机制尚不成熟，在移植后建立完善的血运后，才逐渐继续成熟，具备完善的血糖响应机制。
[0005]因此，目前存在的问题是亟需研究开发一种能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制的新型胰岛类器官及其构建方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于为解决现有技术中存在的缺陷，提供一种血管化胰岛微器官及其构建方法。该血管化胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。
[0007]为此，本专利技术第一方面提供了一种血管化胰岛微器官，其由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖
和功能性血管生成因子。
[0008]本专利技术第二方面提供了一种用于培养血管化胰岛微器官的凝胶组合物，其由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)混合而成。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1
‑
2.5):(1
‑
2.5):(2
‑
5)。
[0010]本专利技术第三方面提供了一种本专利技术第一方面所述的血管化胰岛微器官的培养方法，其包括：
[0011]步骤A，在低温下配制凝胶组合物，并将其转移到孔板中，孵育，获得基质凝胶床；
[0012]步骤B，分别独立地培养MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，直至达到目标细胞覆盖度，分别获得各细胞的初级培养物；
[0013]步骤C，分别独立地对各细胞的初级培养物进行消化处理，直至达到目标分离度标，获得各细胞消化后的初级培养物；
[0014]步骤D，分别独立地用经预冷的中和剂处理各细胞消化后的初级培养物以中和胰酶，收集细胞悬液，离心处理，除去上清液，将所获得的沉淀重悬于DMEM中，离心处理，除去上清液，分别获得各细胞的单细胞沉淀；
[0015]步骤E，分别独立地将各细胞的单细胞沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数；
[0016]步骤F，混合MIN6单细胞、MS1单细胞和MSCs单细胞，获得细胞混合物；
[0017]步骤G，对细胞混合物进行离心处理，并去除上清液，获得细胞悬浮液；
[0018]步骤H，将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，孵育，并观察细胞形成3D结构，孵育完成后获得血管化胰岛微器官；
[0019]其中，所述凝胶组合物为本专利技术第二方面所述的凝胶组合物。
[0020]根据本专利技术方法，在步骤F中，所述细胞混合物中MIN6单细胞与MS1单细胞和MSCs单细胞的细胞个数比为10:(5
‑
7):(2
‑
3)。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，在步骤A中，所述低温为0
‑
8℃，优选为0
‑
4℃。
[0022]本专利技术中，所述凝胶组合物中Collagen I的pH值为7.4。
[0023]在本专利技术的一些实施例中，在步骤D中，所述预冷的温度为0
‑
8℃，优选为0
‑
4℃。
[0024]在本专利技术的另一些实施例中，在步骤B中，所述目标细胞覆盖度为细胞覆盖度≥80％
‑
90％。
[0025]在本专利技术的又一些实施例中，在步骤C中，所述目标分离度为90％。
[0026]根据本专利技术，在步骤D和G中，所述离心处理的温度4℃，所述离心处理的时间为5分钟。
[0027]在本专利技术的一些实施例中，在步骤H中，在所述孵育温度为37℃。
[0028]在胰岛微器官的构建过程中，我们以供能核心血管内皮细胞的研究为主，通过加入血管内皮细胞，间充质干细胞与胰岛细胞共培养，细胞间相互作用，产生胰岛细胞生长所需的细胞因子，促进胰岛微器官血管系统的生长。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：
[0029](1)小鼠血管内皮细胞和人间充质干细胞产生多种细胞因子，如调节胰腺β细胞增殖和功能的血管生成因子。不需要额外添加其他细胞因子。
[0030](2)有了内皮细胞的加入，为胰岛类器官提供了血管供能支撑，使血糖供能模型更加完善。
[0031](3)在本实验中减少了基质胶的比例，通过加入Collagen I，替代部分基质胶，节约了试验成本。
附图说明
[0032]下面将结合附图对本专利技术做进一步的阐述。
[0033]图1示出本专利技术中胰岛微器官培养过程中细胞的1
‑
4天逐渐由平面聚集成球的过程(延时成像)。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本专利技术。但在详细描述本专利技术前，应当理解本专利技术不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
[0035]除非另有定义，本文中使用的所有术语与本专利技术所属领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血管化胰岛微器官，其由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子。2.一种用于培养血管化胰岛微器官的凝胶组合物，其由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)混合而成。3.根据权利要求2所述的凝胶组合物，其特征在于，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1
‑
2.5):(1
‑
2.5):(2
‑
5)。4.一种如权利要求1所述的血管化胰岛微器官的培养方法，其包括：步骤A，在低温下配制凝胶组合物，并将其转移到孔板中，孵育，获得基质凝胶床；步骤B，分别独立地培养MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，直至达到目标细胞覆盖度，分别获得各细胞的初级培养物；步骤C，分别独立地对各细胞的初级培养物进行消化处理，直至达到目标分离度标，获得各细胞消化后的初级培养物；步骤D，分别独立地用经预冷的中和剂处理各细胞消化后的初级培养物以中和胰酶，收集细胞悬液，离心处理，除去上清液，将所获得的沉淀重悬于DMEM中，离心处理，除去上清液，分别获得各细胞的单细胞沉淀；步骤E，分别独立地将各细胞的单细胞沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数；步骤F，混合MIN6单细胞、MS1单细胞和MSCs单细胞，获得细胞混合物；步骤G，对细胞混合物进行离心处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐民，王承志，宫晓艳，朱佳玉，陈杰，杜建英，连雨璇，
申请(专利权)人：北京赛拉达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：