高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术涉及组织培养技术领域，具体涉及高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。本发明专利技术采用自主研发的96孔高通量气液交界类器官培养装置和配套的体系进行神经胶质瘤类器官的培养和传代，相较于传统的培养方法，本发明专利技术体系小、通量高，可以直接实现类器官的原位接种、换液和药敏测试，大大提高了实验的效率，节约了经济和人力成本。同时本发明专利技术方法培养细胞组织活率高、周期短，保留了类器官组织的异质性，更利于进行患者药物反应性的预测，对于研究药物对于神经胶质瘤的作用非常重要。常重要。

【技术实现步骤摘要】
高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法


[0001]本专利技术涉及本专利技术涉及组织培养
，具体涉及高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。

技术介绍

[0002]肿瘤类器官(Patient derived organoids,PDOs)是用取自患者肿瘤组织，在实验室中培养出的高度模拟来源肿瘤组织特征，保留原代组织的遗传特征和肿瘤异质性的微型的体外器官模型。肿瘤类器官通常用于疾病模型构建、机制研究和针对患者的个体化精准用药的筛选。
[0003]神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤。目前对于神经胶质瘤的治疗，主张以手术切除为主，结合放射治疗、化学治疗、电场治疗和免疫治疗。类器官在对胶质瘤患者进行个体化精准医疗方面具有重要的作用，特别是在化疗方案的制定方面具有特殊的意义。随着对肿瘤发生机制的深入认识，越来越多的证据表明，肿瘤的发生与免疫逃逸密不可分。免疫治疗无疑是胶质瘤治疗研究的重点，也是将来临床治疗胶质瘤方案的重要补充。
[0004]肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)是由肿瘤相关基质细胞、免疫细胞，以及相应细胞的分泌产物(如细胞因子和趋化因子)和细胞外基质(ECM)中的非细胞成分组成的。肿瘤微环境为肿瘤提供了良好的生长环境和营养物质，促进肿瘤的进展和转移，这也是临床中导致许多个体患者常规治疗失败的原因。肿瘤类器官相对于PDX动物模型，体外培养环境相对单纯，而缺乏肿瘤微环境的类器官模型，又很难完全模拟肿瘤对于药物的反应性，特别是免疫细胞随着肿瘤类器官的培养，会逐渐功能下降、数量减少，甚至于逐渐消失。
[0005]目前神经胶质瘤类器官的培养方法是机械破碎法，使用弹力剪将肿瘤组织剪成1mm3的碎片，加入培养液，在水平摇床上震荡培养。研究结果证明，随着类器官的培养肿瘤免疫细胞会大量的损失，肿瘤免疫微环境受到了很大的破坏。有文献报道采用气液交互法(air
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liquid interface,ALI)培养组织来源的类器官，可以在一定程度上保留组织原位的免疫微环境。采用ALI方法培养神经胶质瘤类器官无需摇床，组织处理方法简单，但神经胶质瘤类器官的扩增效率低下，培养时间长，且药物敏感性测试很难实现高通量，因此需要开发一种可提高神经胶质瘤类器官的扩增效率、减少培养时长，能高通量完成药物敏感性测试的方法。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。
[0007]本专利技术提供了神经胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于，其为在黏附有基质胶培养媒介培养容器中，在培养液存在的条件下对神经胶质瘤类器官进行培养和传代；
[0008]所述培养容器包括容器主体和位于主体中的实验槽；所述实验槽包括凹槽和凸台结构；所述凹槽的侧方为凹槽侧壁，所述凸台结构与所述凹槽底面连接，所述凸台结构位于
所述凹槽内，所述凸台结构具有水平顶面；
[0009]进一步的，所述凹槽盛有培养液；所述凸台结构的水平顶面黏附有基质胶培养媒介。
[0010]更进一步的，
[0011]所述凹槽内培养液的液面接触基质胶培养媒介但不没过基质胶培养媒介；所述凸台结构与凹槽的凹槽侧壁具有间隔，所述凸台结构的高度小于所述凹槽侧壁的高度；
[0012]可选的，所述凹槽为圆柱体凹槽；
[0013]可选的，所述凸台结构为圆柱体凸台，进一步的，所述凸台的直径为3～3.5mm。
[0014]可选的，所述培养容器主体具有多个所述实验槽；
[0015]可选的，所述多个实验槽在所述容器主体上成阵列式排布。
[0016]本专利技术中，所述的培养方法中，所述基质胶培养媒介包括基底和神经胶质瘤原代组织；
[0017]所述基底包括培养液和基质胶，所述培养液与基质胶的体积比为1：1；所述基底黏附于凸台的水平顶面；
[0018]所述神经胶质瘤原代组织黏附于所述基底上。
[0019]进一步的，
[0020]所述基底黏附于凸台的水平顶面的步骤为：将所述培养液和基质胶混合后置于凸台结构的水平顶面上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，5min。
[0021]本专利技术中，所述基质胶凝固时间条件为30分钟左右5分钟，此条件可实现基底的半凝固，使神经胶质瘤原代组织可以有一部分嵌入半凝固的胶中，起到固定的作用。
[0022]本专利技术所述基质胶培养媒介中，
[0023]所述基底的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
[0024]本专利技术提供了药敏检测方法，其包括：以本专利技术所述的培养方法培养神经胶质瘤类器官，其中，培养容器凹槽中添加培养液培养4～7天后置换凹槽培养液为含有待测药物的培养液，根据神经胶质瘤类器官生长状态，获得药敏检测结果。
[0025]进一步的，所述培养液包括但不限于Advanced
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DMEM细胞培养液、MEM细胞培养液、DMEM细胞培养液、RPMI1640细胞培养液或F
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12细胞培养液中的任意一种；所述待测药物包括但不限于细胞毒类的药物、靶向药物、免疫制剂和/或中成药制剂中的至少一种；所述细胞毒类的药物包括但不限于顺铂、卡铂、紫杉醇、氟尿嘧啶和/或丝裂霉素；所述靶向药物包括但不限于埃克替尼、厄洛替尼、吉非替尼、安罗替尼、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、赫赛汀和/或美罗华等；所述免疫制剂包括帕姆单抗和/或纳武单抗；所述中成药制剂包括但不限于鸦胆子油乳和/或华蟾素。
[0026]更进一步的，所述药敏实验的判断标准可以直接根据类器官的大小变化来判断，通过比较给药前后的类器官大小和生长情况来判定药敏结果；所述药敏实验的判断标准也可以根据显微镜下类器官形态判断，若显微镜下类器官缩小，边缘出现细胞崩解，说明药物有效；此外所述药敏实验的判断标准还可以在实验结束后，采用试剂盒检测细胞活力，计算细胞死亡率来判定；也可以在实验结束后组织包埋切片染色，检测细胞凋亡来判定。
[0027]本专利技术采用自主研发的96孔高通量气液交界类器官培养装置和配套的体系进行
神经胶质瘤类器官的培养和传代，相较于传统的培养方法，本专利技术体系小、通量高，可以直接实现类器官的原位接种、换液和药敏测试，大大提高了实验的效率，节约了经济和人力成本。同时本专利技术方法培养细胞组织活率高、周期短，保留了类器官组织的异质性，更利于进行患者药物反应性的预测，对于研究抗体药物对于神经胶质瘤的作用非常重要。
附图说明
[0028]图1示96孔无菌气液交界类器官培养装置结构正
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剖面结构图；
[0029]图2示培养柱顶部的基质胶包被面；
[0030]图3示类器官接种和培养；
[0031]图4示神经胶质瘤类器官的组织学特征与免疫细胞，其中A,B：神经胶质瘤类器官；C:GFAP是胶质纤维酸性蛋白，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.神经胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于，其为在黏附有基质胶培养媒介的培养容器中，在培养液存在的条件下对神经胶质瘤类器官进行培养和传代；所述培养容器包括容器主体和位于主体中的实验槽；所述实验槽包括凹槽和凸台结构；所述凹槽的侧方为凹槽侧壁，所述凸台结构与所述凹槽底面连接，所述凸台结构位于所述凹槽内，所述凸台结构具有水平顶面；所述凹槽内盛有培养液；所述凸台结构的水平顶面黏附有基质胶培养媒介。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述凹槽内培养液的液面接触基质胶培养媒介但不没过基质胶培养媒介。3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述凸台结构与凹槽的凹槽侧壁具有间隔，所述凸台结构的高度小于所述凹槽侧壁的高度。4.根据权利要求1～3任一项所述的培养方法，其特征在于，所述凹槽为圆柱体凹槽；所述凸台结构为圆柱体凸台。5.根据权利要求1～4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述凸台的直径为3～3.5mm。6.根据权利要求1～5任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养容器主体具有多个所述实验槽；所述多个实验槽在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐民，郭志英，连雨璇，宫晓艳，张雪晨，
申请(专利权)人：北京赛拉达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：