构建鼠类皮肤类器官的方法技术

本发明专利技术涉及类器官技术领域领域，公开了一种构建鼠类皮肤类器官的方法。所述方法包括将鼠类皮肤原代细胞置于鼠类皮肤类器官培养液中进行类器官培养，其中，所述鼠类皮肤类器官培养液中含有烟酰胺、地塞米松和Y

【技术实现步骤摘要】
构建鼠类皮肤类器官的方法


[0001]本专利技术涉及类器官
，具体涉及一种构建鼠类皮肤类器官的方法。

技术介绍

[0002]类器官属于三维(3D)细胞培养物，与对应的人体器官具有高度相似的组织学特征，能重现器官的部分生理功能。这些3D系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。类器官去除了动物模型可能引入的混淆变量，但与均一化的2D细胞培养物相比，则提供更高度的复杂性。通过结合高水平的生理相关性与体外操作的便宜性，在许多情况下，类器官具有辅助或替代体外使用原代细胞或永生化细胞系和动物实验的潜力。另外，类器官在培养中具有高度基因稳定性，维持了来源组织的基因型与表型。因此，类器官在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个领域拥有广泛的应用前景。
[0003]皮肤是人体最大的器官，皮肤病的种类不但繁多，而且引起皮肤病的原因很多，而且许多内脏疾病在皮肤上也有相应的表征体现，因此动物模型在皮肤病的研究上由于其混淆变量较多而难以提供较为准确的结论。而且，许多皮肤病，比如感染因素引起的皮肤病，如麻风、疥疮、真菌病、皮肤细菌感染等常常有一定的传染性，不但影响身体健康，而且引起恐慌与社会歧视。目前已有研究人员采用人体皮肤组织(例如病人自身提供的皮肤组织等)进行类器官培养，并进行针对性的治疗方案研究和药物研发等工作。但是，人源样本的获取途径较少，其使用也存在许多伦理学方面的限制，因此，对动物源的皮肤类器官开发对于研究工作的开展能够提供更多的便利性。然而，目前暂未有任何关于动物皮肤类器官构建的方法报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的人类皮肤类器官构建过程中样本来源少，且使用过程中受到伦理约束多，限制了研究工作的开展等问题，提供一种构建鼠类皮肤类器官的方法，该方法能够实现鼠类皮肤类器官的高效构建、传代和扩增。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种构建鼠类皮肤类器官的方法，所述方法包括将鼠类皮肤原代细胞置于鼠类皮肤类器官培养液中进行类器官培养，其中，所述鼠类皮肤类器官培养液中含有烟酰胺、地塞米松和Y27632。
[0006]本专利技术第二方面提供第一方面所述的方法中采用的鼠类皮肤类器官培养液。
[0007]通过上述技术方案，本专利技术至少能够取得如下有益效果：
[0008](1)本专利技术提供的方法采用鼠类皮肤组织(或其原代细胞)为原料，来源广泛，也避免了人源实验材料带来的伦理问题限制。而且能够根据不同的研究需要选择特定的鼠类皮肤进行皮肤类器官制备，具有产品适用性广的优点。
[0009](2)本专利技术提供的方法制备鼠类皮肤类器官的流程简单，快速，高效，能够有效提高实验效率。而且，本专利技术提供的方法中，鼠类皮肤类器官的构建、传代和扩增均采用同一
种培养液，降低了目前大多数类器官培养方法中因不同阶段使用不同培养液造成实验失误的可能性。
[0010](3)本专利技术提供的方法用于鼠类皮肤类器官制备时具有较高的成功率。
附图说明
[0011]图1是实施例1中制备获得的C57小鼠皮肤组织类器官的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
[0012]图2
‑
4分别为实施例2中采用不同鼠类皮肤类器官培养液构建的C57小鼠皮肤组织类器官的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
[0013]图5和图6分别为实施例3中采用通过不同消化液获得的小鼠皮肤原代细胞构建的C57小鼠皮肤组织类器官的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
具体实施方式
[0014]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0015]本专利技术的专利技术人在研究中巧妙地发现，直接将鼠类皮肤原代细胞置于特定培养基中进行培养，即可获得鼠类皮肤类器官。经过进一步研究，专利技术人发现，在基础培养基(如Advanced DMEM/F12培养基等)中添加特定小分子物质时，能够有效提高鼠类原代皮肤细胞构建出皮肤类器官的构建效率和成功率。并且该培养基能够在鼠类皮肤类器官的构建、扩培和传代时通用，极大简化了鼠类皮肤类器官构建的实验流程，减少了因错用培养基导致的实验失误和材料浪费。
[0016]基于此，本专利技术一方面提供一种构建鼠类皮肤类器官的方法，所述方法包括将鼠类皮肤原代细胞置于鼠类皮肤类器官培养液中进行类器官培养，其中，所述鼠类皮肤类器官培养液中含有烟酰胺、地塞米松和Y
‑
27632。
[0017]地塞米松(Dexamethasone，DXMS)是一种人工合成的皮质类固醇，CAS号为50
‑
02
‑
2。
[0018]Y
‑
27632是一种RHO/ROCK通路抑制剂，CAS号为146986
‑
50
‑
7，结构式如下式(I)所示(通常以二盐酸盐的形式供应)。
[0019][0020]根据本专利技术的优选实施方式，其中，所述鼠类皮肤类器官培养液的成分包括基础培养基和添加剂，优选所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
[0021]优选地，所述添加剂包括4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、L
‑
谷氨酰胺补充剂、N
‑
2添加剂、B
‑
27添加剂、N
‑
乙酰半胱氨酸、R
‑
脊椎蛋白(R
‑
Spondin，RSPO)、表皮细胞生长因子
(EGF)、WNT蛋白、头蛋白(Noggin)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、牛血清蛋白(BSA)、A83
‑
01、SB202190、毛喉素(Forskolin)、烟酰胺、地塞米松、Y
‑
27632和抗生素。优选所述抗生素选自青霉素、链霉素和两性霉素B中的至少一种。
[0022]本专利技术中，L
‑
谷氨酰胺补充剂是指能够为培养基提供L
‑
谷氨酰胺的化合物，任意本领域中具有上述功能的物质均可适用于本专利技术。例如可以为L
‑
谷氨酰胺、L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺二肽。本专利技术对于L
‑
谷氨酰胺补充剂的具体来源没有特别限制，其既可以为根据现有技术自行制备的产物，也可以为直接通过商购获得的相关产品(例如GlutaMAX
TM
等)。
[0023]N2添加剂和B27添加剂都是用于培养基中的无血清添加剂，其可为培养基提供多种营养物质和细胞因子，通常可以通过商购途径获得。购买获得的N2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
U/mL，脱氧核糖核酸酶I的含量为0.05
‑
0.2mg/mL。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述消化的条件包括：消化液A与鼠类皮肤组织碎片的体积比为5
‑
15∶1，消化温度35
‑
38℃，消化时间40
‑
80min，优选在100
‑
200rpm的震荡条件下进行消化；优选地，所述鼠类皮肤组织碎片的面积不超过3cm2，优选为1
‑
2cm2。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述类器官培养的方式包括：将鼠类皮肤原代细胞采用基质胶包被后，置于鼠类皮肤类器官培养液中进行培养；优选地，所述培养的条件包括：温度36
‑
38℃，3
‑
5天更换一次培养液；优选地，所述鼠类皮肤类器官培养液的用量不超过培养容器容积的30％。8.根据权利要求7所述的方法，其中，采用基质胶包被鼠类皮肤原代细胞的方式包括：将在冰上冷却过的鼠类皮肤原代细胞悬液与基质胶混合，并将获得的混悬液加入培养容器中，在36
‑
38℃条件下使混悬液凝固；优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐民，何萌萌，郭志英，宫晓艳，张乾，王承志，
申请(专利权)人：北京赛拉达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：