肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官的构建方法技术

本发明专利技术涉及肠上皮类器官培养相关技术，具体涉及一种肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官构建方法。所述肠上皮类器官构建方法包括：步骤1，分类肠隐窝；步骤2，培养肠隐窝，获得单层肠原代细胞；步骤3，用重组胰蛋白酶对单层肠原代细胞进行消化，得到消化后的细胞；步骤4，利用基质胶对消化后的细胞进行重悬后进行培养，获得肠上皮类器官。所述基因修饰肠上皮类器官构建方法是在上述方法基础上在步骤2培养过程中感染慢病毒颗粒。本发明专利技术的方法培养时间短，且可获得的大量肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官。肠上皮类器官。

【技术实现步骤摘要】
肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官的构建方法


[0001]本专利技术涉及肠上皮类器官培养相关技术，具体涉及一种肠上皮基因修饰类器官培养方法。

技术介绍

[0002]肠上皮类器官的出现极大地促进了对消化系统正常发育和生理学以及消化系统疾病发病机制的理解。
[0003]随着基因工程技术的发展，基因修饰肠上皮类器官正在被探索作为永生化细胞系和基因工程动物的潜在替代品。然而，现有肠上皮类器官的基因操作耗时、繁琐，且形成有效的同质基因修饰类器官的效率远远不能令人满意，限制基因递送效率的两个主要障碍是三维培养条件和在细胞悬浮条件中进行的基因传递。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术一方面提供了一种肠上皮类器官构建方法。
[0005]为此，本专利技术提供的肠上皮类器官构建方法包括：
[0006]步骤1，分离肠隐窝；
[0007]步骤2，培养肠隐窝，获得原代单层肠上皮细胞；
[0008]步骤3，用重组胰蛋白酶对原代单层肠上皮细胞进行消化，得到消化后的细胞；
[0009]步骤4，利用基质胶对消化后的细胞重悬后进行培养，获得肠上皮类器官。
[0010]本专利技术还提供了一种基因修饰肠上皮类器官构建方法。为此，本专利技术所提供的基因修饰肠上皮类器官构建方法包括：
[0011]步骤一，分离肠隐窝；
[0012]步骤二，培养肠隐窝，培养过程中向培养体系中加入感染体系进行感染，获得基因修饰原代单层肠上皮细胞；所述感染体系包括慢病毒；
[0013]步骤三，用重组胰蛋白酶对基因修饰原代单层肠上皮细胞进行消化，得到消化后的细胞；
[0014]步骤四，利用基质胶对消化后的细胞重悬后进行培养，获得基因修饰肠上皮类器官。
[0015]可选方案中，所述感染体系包括慢病毒和培养液，所述培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自ROCK抑制剂、EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自DMEM/F12培养液或intestiCULT类器官培养液。
[0016]可选的方案是，本专利技术相应步骤培养过程中用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自ROCK抑制剂、EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自DMEM/F12培养液或intestiCULT类器官培养液。
[0017]本专利技术的方法培养时间短，且可获得的大量肠上皮类器官构建方法及基因修饰肠上皮类器官。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例1的培养结果表征图；A：小鼠小肠隐窝的代表性图像；B：肠隐窝接种后4小时形成单层原代肠上皮细胞的代表性图像；C：从单层原代肠上皮细胞建立的肠类器官第0代(P0)、第5代(P5)和第12代(P12)第8天的代表图像；D：原代单层肠上皮细胞构建的类器官表达各种肠道分化标记分子的代表性图像。
[0019]图2为本专利技术实施例2的培养流程及结果表征图；A：本专利技术的培养流程示意图；B：慢病毒感染48小时后原代单层肠上皮细胞的代表性图像(上图为原代单层肠上皮细胞的代表性图像，下图为慢病毒感染48小时后与上图同一视野细胞的代表性图像)；C：慢病毒感染的原代单层肠上皮细胞产生的肠上皮类器官的典型图像(中间图为慢病毒感染72小时后明场下肠上皮类器官的代表性图像，四幅图显示了与中间图同一时间同一视野的不同层面的类器官代表性图像)。
[0020]图3为对比例1方法建立基因修饰肠类器官；A、对比例方法建立基因修饰肠道类器官流程示意图；B、采用对比例1方法(Andersson
‑
Rolf et al.,2014；Van Lidth de Jeude et al.,2015)培养的GFP标记肠上皮类器官代表性图(左上图为感染前该对比例得到的肠类器官的代表性图，右上图为与左上图同一视野的感染后的肠上皮类器官的代表性图；左下图为感染前该对比例另一视野的肠类器官的代表性图，右下图为与左下图同一视野的感染后的肠上皮类器官的代表性图)；C、定量分析对比例1方法(traditional)和本专利技术方法培养(实施例2，sequential)的GFP阳性肠上皮类器官百分比，数据表示为平均值
±
标准差，***P<0.001；D、定量对比分析从对比例1和本专利技术方法培养(实施例2)的GFP“马赛克”阳性肠上皮类器官百分比，数据表示为平均值
±
标准差，***P<0.001。
[0021]图4为对比例2利用脂质体介导的质粒感染构建基因修饰肠上皮类器官；A、对比例2利用脂质体介导的质粒感染构建基因修饰肠上皮类器官流程示意图；B、质粒感染72小时后原代单层肠上皮细胞代表性图像。
具体实施方式
[0022]除非有特殊说明，本文中的术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。本专利技术方法中所述分离肠隐窝可采用现有相关方法或改进后的方法实现，目的是获得用于后期培养的肠隐窝。所述培养肠隐窝是采用合适的培养液在适宜调价下进行培养，可采用本专利技术提供的培养基进行培养，也可采用现有相关方法实现以获得原代单层肠上皮细胞。在构建基因修饰肠上皮类器官过程中，在肠隐窝培养过程中或培养一段时间后在肠隐窝的培养体系中加入感染体系进行感染，继续培养后获得基因修饰原代单层肠上皮细胞。
[0023]适用于本专利技术的慢病毒为常规慢病毒颗粒，可选用市售慢病毒，例如但不局限于以下慢病毒颗粒：Scramble msgRNA慢病毒对照载体pLV[Exp]‑
EGFP:T2A:Pu ro
‑
EF1A>mCherry(购自Vector Builder,货号：VB010000
‑
9298rtf)，其克隆宿主为Stbl3。
[0024]本专利技术的所有培养环节的培养条件包括温度、CO2含量需满足细胞的生长条件。以下实施例中所用培养条件为温度37℃，5％ CO2。
[0025]本专利技术各培养环节所用培养液可在本领域已公开培养液中选择合适的培养液或添加相应生长因子的基础培养液。其中的生长因此可选自ROCK抑制剂、EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin中的一种或两种以上；基础培养液可选自DMEM/F12培养液或intestiCULT类器
官培养液。
[0026]例如，含EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin的DMEM/F12培养液。具体配方示例为(每毫升基础培养液)：EGF：50ng/ml；Wnt3a：100ng/ml；noggin：100ng/ml；R
‑
sponding：500ng/ml。以下实施例以含ROCK抑制剂的intestiCULT类器官培养液(购自Stem Cell，Cat#06005)为例对本专利技术进行解释说明。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠上皮类器官构建方法，其特征在于，方法包括：步骤1，分离肠隐窝；步骤2，培养肠隐窝，获得原代单层肠上皮细胞；步骤3，用重组胰蛋白酶对原代单层肠上皮细胞进行消化，得到消化后的细胞；步骤4，利用基质胶对消化后的细胞重悬后进行培养，获得肠上皮类器官。2.根据权利要求1所述的肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤2培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自ROCK抑制剂、EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自DMEM/F12培养液或intestiCULT类器官培养液。3.根据权利要求1所述的肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤4培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自ROCK抑制剂、EGF、wnt3a、noggin和R
‑
spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自DMEM/F12培养液或intestiCULT类器官培养液。4.一种基因修饰肠上皮类器官构建方法，其特征在于，方法包括：步骤一，分离肠隐窝；步骤二，培养肠隐窝，培养过程中加入向培养体系中加入感染体系进行感染，继续培养后获得基因修饰原代单层肠上皮细胞；所述感染体系包括慢病毒；步骤三，用重组胰蛋白酶对基因修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：董加强，聂勇战，吴开春，韩渭丽，王睿，赵晟，陶海强，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：