人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法技术

本发明专利技术涉及分子细胞生物学领域，具体涉及人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法；将待处理人体组织先与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30

【技术实现步骤摘要】
人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，具体为从人体皮肤组织中对人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法。

技术介绍

[0002]利用体外重组皮肤模型替代动物实验和人体临床，为日化制品对人体皮肤造成的影响进行评估试验越来越被重视，不仅解决了以往试验受到的临床伦理和动物保护福利的限制，还解决了成本高、测试规模有限、不能高通量进行的等一系列的缺陷。皮肤模型的构建主要包括表皮层和真皮层，表皮层是由角质形成细胞分化形成，真皮层主要是由成纤维细胞构成，两种细胞的一个双旁分泌信号概念促进了皮肤的形成。已知两种细胞可由人体皮肤组织中提取，因此，一种简单高效的从人体组织中提取原代角质形成细胞和成纤维细胞的方法对于成功构建体外重组皮肤模型至关重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，该方法包括以下步骤：
[0005]s1、获取人体皮肤组织时需要储存在含有双抗的PBS中，4度保存，处理组织时使用PBS清洗3
‑
5次，尽可能除去血污和结缔组织；将待处理人体皮肤组织与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30
‑
60min，使用dispaseII中性分离酶与组织共孵育时，需将待处理样品剪成宽约0.5mm，长约2cm的小长条，且dispaseII中性酶的加入量为样品体积的3
‑
5倍；
[0006]s2、取出组织进行4℃低烈度超声后机械分离得到表皮层和真皮层，分别对其进行低温苏醒；机械分离组织时，需要将组织固定在含有PBS的加样槽中，保持组织的湿润，使用镊子使其分离；低温苏醒为将组织放于PBS中与维生素C、GLX351322、Fulvene
‑
5和多烯磷脂酰胆碱于15
‑
20℃共同孵育1
‑
2h，其中维生素C用量25ug/ml
‑
75ug/ml；GLX351322用量0.3
‑
0.4μM；Fulvene
‑
5用量0.5
‑
1.0μM；多烯磷脂酰胆碱用量30
‑
50μM，总体积设定为组织样品的2
‑
3倍；
[0007]s3、胰酶处理提取细胞，将表皮层和真皮层剪碎后加入胰酶(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，消化过程需要在摇床中进行，温度设置为37℃，转速设置为180rpm，其中表皮层胰酶消化10
‑
15min过滤得到角质形成细胞，真皮层胰酶消化30
‑
45min过滤得到成纤维细胞；胰酶的添加量为组织样品的3
‑
5倍；
[0008]s4、培养基进行细胞培养，过滤后得到的细胞沉淀需要在无血清培养基中洗脱两次，角质形成细胞需要使用不添加血清的Epilife培养基洗脱，原代用Epilife培养基培养，传代后使用特定培养基；成纤维细胞需要使用不添加血清的DMEM培养基洗脱，原代成纤维细胞的培养使用添加20％血清的DMEM培养基，传代后使用含10％血清的DMEM培养基。
[0009]作为本专利技术的进一步方案：在步骤s1中，所述dispaseII中性分离酶需要用10mMNaAc(PH7.5)和5mMCaAc的缓冲液或Hepe缓冲盐溶液制备终浓度为2.4u/ml的储存液，并用0.22uM滤膜过滤除菌4度保存。
[0010]作为本专利技术的进一步方案：在s2步骤中，低烈度超声的功率为50
‑
80W、发射频率为20
‑
30KHz、振幅为20
‑
40％、时间为5
‑
10min。
[0011]作为本专利技术的进一步方案：在步骤s4中，过滤所用滤网采用200目筛。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用低烈度超声处理皮肤组织，加快了表皮层和真皮层分离速度，提高了细胞提取效率；本专利技术采用独创的低温苏醒技术，缓解了超声对细胞的损伤，显著增强了活细胞数量。两项操作的进行更好的保持了细胞组织原有的活性。其次针对表皮层中存在角质形成细胞和成纤维细胞共存的情况，本专利技术独创了胰酶二次消化技术，成功的从角质形成细胞中分离出成纤维细胞，大大提高了提取的角质形成细胞的纯度。现有的技术大部分是通过增加传代次数来减少成纤维细胞的存活量，实现提高角质形成细胞的纯度，相比于现有技术，本专利技术减少了细胞传代次数，节约了时间，提高了提取效率，易于梳理、提取活细胞。
附图说明
[0013]图1为实施例1中角质层中原代细胞图；
[0014]图2为实施例2中角质层中原代细胞图；
[0015]图3为实施例3中角质层中原代细胞图；
[0016]图4为实施例4中角质层中原代细胞图；
[0017]图5为表皮分离后的图像；
[0018]图6为真皮分离后的图像；
[0019]图7角质形成细胞提取培养后的图像；
[0020]图8成纤维细胞提取培养后的图像。
具体实施方式
[0021]以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。
[0022]本专利技术提取手段能够有效的从皮肤组织中提取出原代角质形成细胞和成纤维细胞，为后续试验提供细胞供给基础。
[0023]为了能够有效的从皮肤组织中提取出原代角质形成细胞和成纤维细胞，为后续试验提供细胞供给基础；本专利技术提供一种技术方案：人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，该方法包括以下步骤：
[0024]s1、获取人体皮肤组织时需要储存在含有双抗的PBS中，4度保存，处理组织时使用PBS清洗3
‑
5次，尽可能除去血污和结缔组织；将待处理人体皮肤组织与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30
‑
60min，使用dispaseII中性分离酶与组织共孵育时，需将待处理样品剪成宽约0.5mm，长约2cm的小长条，且dispaseII中性酶的加入量为样品体积的3
‑
5倍；
[0025]s2、取出组织进行4℃低烈度超声后机械分离得到表皮层和真皮层，分别对其进行低温苏醒；机械分离组织时，需要将组织固定在含有PBS的加样槽中，保持组织的湿润，使用
镊子使其分离；低温苏醒为将组织放于PBS中与维生素C、GLX351322、Fulvene
‑
5和多烯磷脂酰胆碱于15
‑
20℃共同孵育1
‑
2h，其中维生素C用量25ug/ml
‑
75ug/ml；GLX351322用量0.3
‑
0.4μM；Fulv本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：s1、获取人体皮肤组织时需要储存在含有双抗的PBS中，4度保存，处理组织时使用PBS清洗3
‑
5次，尽可能除去血污和结缔组织；将待处理人体皮肤组织与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30
‑
60min，使用dispaseII中性分离酶与组织共孵育时，需将待处理样品剪成宽约0.5mm，长约2cm的小长条，且dispaseII中性酶的加入量为样品体积的3
‑
5倍；s2、取出组织进行4℃低烈度超声后机械分离得到表皮层和真皮层，分别对其进行低温苏醒；机械分离组织时，需要将组织固定在含有PBS的加样槽中，保持组织的湿润，使用镊子使其分离；低温苏醒为将组织放于PBS中与维生素C、GLX351322、Fulvene
‑
5和多烯磷脂酰胆碱于15
‑
20℃共同孵育1
‑
2h，其中维生素C用量25ug/ml
‑
75ug/ml；GLX351322用量0.3
‑
0.4μM；Fulvene
‑
5用量0.5
‑
1.0μM；多烯磷脂酰胆碱用量30
‑
50μM，总体积设定为组织样品的2
‑
3倍；s3、胰酶处理提取细胞，将表皮层和真皮层剪碎后加入胰酶(胰蛋白酶0.25％，EDTA0....

【专利技术属性】
技术研发人员：徐明恺，张博文，刘时光，赵冬梅，杨宗艺，刘双，张志强，吕静，王宇，霍冉，
申请(专利权)人：沈阳泽尔检测服务有限公司，
类型：发明
国别省市：