一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法，将人源上皮细胞和成纤维细胞按照一定比例混合，进行3D培养，这两种细胞会自组装形成类似皮肤的细胞结构，外面是上皮层，内部是真皮层。本发明专利技术制备的皮肤器官模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，可以作为一种体外皮肤模型平台，用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定，具有巨大的应用前景。具有巨大的应用前景。具有巨大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法


[0001]本专利技术属于皮肤组织
，尤其涉及一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法。

技术介绍

[0002]皮肤是人体最大的器官，大体分为三个部分，即由最外侧的表皮层、其下层的真皮层以及皮下组织所构成。它是外界环境与内部器官之间的重要屏障，可以防止身体水分的流失、环境影响、伤害或感染等，而且有助于调节体温。传统的皮肤研究采用动物模型，但随着各项规定的出台及研究平台的发展，应用皮肤组织工程构建皮肤模型模拟天然皮肤，代替动物进行相关安全性测试已成为一种趋势。皮肤模型在不同领域均有广泛应用，如在制药领域，通常使用皮肤模型研究药物的作用机理、发病机制、毒性影响等，因此需要开发具有模拟天然皮肤结构的人造皮肤。
[0003]然而，动物实验不能准确反应人体对于药物和材料的毒性和功效。而传统的2维细胞培养也跟实际的体内生理环境有很大的差异。与2D单层生长的贴壁细胞相比，3D细胞球生长条件被认为可以更真实地反映细胞生长的生理环境。因此科学研究需要体外3维人体细胞模型来更准确的模拟人体的环境，提高研究人体疾病，或筛选药物和材料的毒性和功效的效率。如陈灿等(混合接种法构建组织工程皮肤[J].中华整形外科杂志,2010,26(5):365
‑
368.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009
‑
4598.2010.05.013.)研究了混合接种法体外构建复合皮的可行性，其在脱细胞真皮的真皮面接种成纤维细胞后，将表皮细胞与成纤维细胞混合后接种于表皮面，培养三周后可见表皮层连续，基底膜形成。苏浩(苏浩.利用人表皮干细胞和成纤维细胞3D打印皮肤组织的初步研究[D].江苏:扬州大学,2020.)利用人表皮干细胞和成纤维细胞3D打印皮肤组织，以纤维蛋白原和明胶为支架材料，EpSCs和成纤维细胞为种子细胞，微挤压打印真皮层和表皮层，凝血酶交联。但虽然已有如上所述的多款3D皮肤模型，以及法国T—Skin、美国EpiDerm FT、德国PhenionFT以及中国FulKutis，但是这些商用模型都使用了胶原、壳聚糖凝胶等支架材料或插入式培养器，操作复杂，成本高。
[0004]细胞球为多细胞3D结构，可模拟体内细胞应答和相互作用。它们具有高度可重复性，适合高通量筛选，且无需任何支架材料。而目前尚无关于采用3D细胞球技术构建皮肤类器官的报道。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法，以3D细胞球技术为基础模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，可以作为一种体外皮肤模型平台，用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定。而且这种方法非常高效稳定，可以根据需要低成本一次生产10
‑
10000个进行实验。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1、分别制备上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液；
[0008]S2、将上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液混合，进行3D培养，使上皮细胞和成纤维细胞自组装成具有双层结构的细胞球，得到所述无支架3D细胞球结构皮肤器官。
[0009]进一步地，上皮细胞悬浮液通过上皮细胞和上皮细胞培养液混合得到。
[0010]进一步地，成纤维细胞悬浮液通过成纤维细胞和成纤维细胞培养液混合得到。
[0011]进一步地，上皮细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。
[0012]进一步地，成纤维细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。
[0013]进一步地，上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液按体积比1:3～15混合。
[0014]进一步地，所述具有双层结构的细胞球中，内层为成纤维细胞，外层为上皮细胞。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供上述构建方法构建得到的无支架3D细胞球结构皮肤器官。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种体外皮肤模型，包括上述无支架3D细胞球结构皮肤器官。
[0017]本专利技术的第四个目的是提供上述无支架3D细胞球结构皮肤器官或体外皮肤模型在制药领域或化妆品领域的应用，如作为药物筛选、毒性评价等的皮肤模型。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术针对现有动物实验和传统的2维细胞培养与实际的人体内生理环境有很大的差异，不能准确反应人体对于药物和材料的毒性和功效，且传统3维皮肤器官制备繁琐的缺陷，提供了一种体外无支架人源皮肤类器官的高效构建方法，模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，它可以作为一种体外疾病模型平台，比如常见的湿疹、痤疮，纤维瘤等皮肤疾病，也可以用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定。这将有助于更好地了解感染、免疫反应、药物或材料对皮肤影响的机理。
附图说明
[0020]图1为本专利技术体外人源皮肤类器官的构造方法示意图；
[0021]图2为实施例1制备的体外人源皮肤类器官的共聚显微镜照片；
[0022]图3为上皮细胞与成纤维细胞比例对体外人源皮肤类器官形成的影响；
[0023]图4为对不同比例制备的皮肤器官进行基因表达和蛋白浓度测试结果；
[0024]图5为胶原1型蛋白染色共聚显微镜图片；
[0025]图6为不同大小的类似皮肤组织结构的细胞球。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0027]下述实施例中涉及的材料如下：
[0028]配制人源上皮细胞悬浮液时，可选择目前已知的任何可以用于培养上皮细胞的培养液，本专利技术中人源上皮细采用RPMI一1640培养基(含10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，在37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿润空气的培养箱中常规培养。
[0029]配制成纤维细胞悬浮液时，可选择目前已知的任何可以用于培养成纤维细胞的培
养液，本专利技术中人源成纤维细胞采用DMEM培养基(含10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，在37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿润空气的培养箱中常规培养。
[0030]制备3D细胞球时，可以采用任何使细胞成球的方法，如超低吸附表面的微孔板、悬滴法、旋转培养、磁力悬浮法等，本专利技术以采用在琼脂糖模具中制备的方式为例说明皮肤器官的形成。
[0031]制备器官模型时，可根据需要进行不同细胞的添加。如需研究毛发生成等，向悬浮液混合物中加入毛囊细胞，并进行培养即可。
[0032]实施例1
[0033]1、人源上皮细胞和成纤维细胞消化离心以后配成106个细胞每毫升的悬浮液。
[0034]2、将人源上皮细胞和成纤维细胞悬浮液共80微升(其中，人源上皮细胞悬浮液与成纤维细胞悬浮液的体积比为1:5)倒入每个细胞不能贴附的琼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、分别制备上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液；S2、将上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液混合，进行3D培养，使上皮细胞和成纤维细胞自组装成具有双层结构的细胞球，得到所述无支架3D细胞球结构皮肤器官。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：上皮细胞悬浮液通过上皮细胞和上皮细胞培养液混合得到。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：成纤维细胞悬浮液通过成纤维细胞和成纤维细胞培养液混合得到。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：上皮细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭禹，文学军，邵漠宇，张浩，
申请(专利权)人：泛领生物医学技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：