子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法技术

本发明专利技术公开了一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，包括：体外建立原代子宫内膜上皮类器官和子宫内膜基质细胞系；改善用于组装子宫内膜腺体样类器官与基质细胞的细胞外基质；构建的子宫内膜类器官模型包含腺体和基质细胞；采用气液界面培养子宫内膜类器官模型，使其具有腔上皮和腺体结构；子宫内膜类器官模型模拟子宫内膜的月经周期以及功能鉴定。本发明专利技术首次建立了同时具有腔上皮和腺上皮的内膜类器官模型，类器官的组织结构、细胞组成、激素诱导变化、基因表达的特征与体内相似，并且能够重现体内胚胎着床所必需的容受性基因和纤毛的动态性；可用于作为研究胚胎着床调控、子宫内膜疾病和再生机制的模型。子宫内膜疾病和再生机制的模型。子宫内膜疾病和再生机制的模型。

【技术实现步骤摘要】
子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法


[0001]本专利技术属于生殖医学以及生物
，具体涉及子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法。

技术介绍

[0002]与其他哺乳动物相比，人类的生育能力是低下的。即使对于健康女性，每个月经周期自然受孕的几率只有30％。据人类生育情况统计，每六对夫妇中就有一对被诊断为不孕不育症，而在这些人群中，约有25％的夫妇又被诊断为不明原因不孕。虽然在临床上运用辅助生殖技术提高生育率，但成功率也仅在40
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55％之间，着床失败是该技术的限速步骤。因为人类目前对于胚胎着床的认识仍不清晰，所以我们需要更好地理解人类母胎界面的交叉对话，了解子宫内膜容受性对胚胎植入的重要性，从而进一步改善妊娠结局，提高不孕夫妇的妊娠率。
[0003]子宫内膜作为胚胎着床的“土壤”，它是成功妊娠的关键。内膜是由覆盖在表层的腔上皮和下方的腺上皮组成的多层结构，前者是胚胎与之发生互作的植入位点，后者为浸润到其中的胚胎提供营养环境。在女性的月经周期，子宫内膜在雌孕激素的作用下处于一种高度动态变化过程，每个周期经历着脱落，再生和分化。人子宫内膜重塑和再生异常可导致不孕、反复流产、子宫内膜肿瘤、炎症、薄型子宫内膜和子宫内膜异位症。尽管对这些疾病的病理学了解较多，但与这些疾病相关的分子和细胞机制仍未解决。因此，剖析子宫内膜生理和病理状况中涉及的细胞和分子机制，有助于更加了解这一动态器官及其相关疾病，并有助于开发新型疗法。目前研究模型大多使用的是永生化的细胞系。在长期传代后，永生化的细胞系在表型和基因型上可能与其原代来源的细胞不同，无法概括这些疾病的性质和异质性，从而阻碍了科学和临床的进步。在2017年，人类和小鼠的子宫内膜腺上皮类器官模型的建立为体外研究提供了新的思路。在体内，细胞处于复杂的微环境中，存在复杂的信号通讯和细胞与细胞间的相互作用，这是建立、维持和调节细胞表型和功能的关键所在。类器官直接从子宫内膜活检中获得，被认为在表型和生理特性上更接近组织细胞，并且采用3D培养模式，更好地展现了其生理功能。因为从动物模型获得的研究结果向人类转化的局限性，人们对人子宫内膜疾病的发病机制知之甚少。类器官的开发推进了二十一世纪精准化治疗的脚步，采用明确遗传背景的类器官模型实现个体化治疗。子宫内膜类器官将成为广泛的生物医学应用的有前途的工具，从疾病建模到个性化医，这将加速我们对涉及子宫内膜发育和疾病的分子和细胞机制的理解。但迄今为止所描述的大多数子宫内膜体外模型仅限于单一的子宫内膜细胞或者缺乏腔上皮结构，无法真实模拟体内子宫内膜的三维结构和功能。
[0004]因此，为了解决上述问题，本文提出子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术设计了子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，本专利技术则建立了子宫内膜腺体上皮类器官和子宫内膜基质细胞之间交流对话的微环境，改善了单一上皮类器官无法真实模拟月经周期特点的缺陷，验证了对激素反应和体内的一致性；本专利技术还结合Matrigel和胶原的特点获得了更优于单独培养子宫内膜腺体类器官和子宫内膜基质细胞的细胞外基质；采用气液界面特殊的培养方式，建立了同时具有腔上皮和腺上皮的内膜类器官模型。
[0006]为了达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1、体外建立原代子宫内膜上皮类器官和子宫内膜基质细胞系；
[0008]S2、改善用于组装子宫内膜腺体样类器官与基质细胞的细胞外基质；
[0009]S3、构建的子宫内膜类器官模型包含腺体和基质细胞；
[0010]S4、采用气液界面培养子宫内膜类器官模型，使其具有腔上皮和腺体结构；
[0011]S5、子宫内膜类器官模型模拟子宫内膜的月经周期以及功能鉴定。
[0012]进一步的，所述的S1中子宫内膜上皮类器官的培养基被称为扩增培养基(Expansion medium，ExM)，其中成分包括Advanced DMEM/F12，N2 supplement，B27 supplement minus vitamin A，青霉素/链霉素，0.5
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2mM N
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Acetyl
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L
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cysteine，0.5
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3mM L
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glutamine，30
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70ng/ml EGF，50
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200ng/ml Noggin，50
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100ng/ml Rspondin
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1，50
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200ng/ml FGF
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10，20
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80ng/ml HGF，200
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1000nM A83
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01，5
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20nM烟酰胺和5
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15nM Y27632。
[0013]进一步的，所述的S1中子宫内膜基质细胞的培养基成分为5
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20％胎牛血清和0.5
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5μg/ml L
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ascorbic acid。
[0014]进一步的，所述的S2中将子宫内膜腺体样上皮类器官与基质细胞的细胞按照一定比例进行混合；改善组装子宫内膜腺体样上皮类器官与基质细胞的细胞外基质，所述细胞外基质为Matrigel和Ⅰ型胶原的混合组成；两者组装后于Transwell小室的上室或培养皿，放于37℃孵育1h以上，待完全固化后再加培养基培养。
[0015]进一步的，所述的S3中构建子宫内膜类器官腔上皮结构，待S2两者的组装体固化后，另收集ExM培养中的子宫内膜类器官于低吸附离心管中，通过反复轻柔吹打和离心的方式去除胞外基质；用ExM培养基重悬获得的细胞沉淀，接着加入Transwell小室的上室，并在下室中加入成分相同的ExM培养基。
[0016]进一步的，所述的S4中采用气液界面培养子宫内膜类器官组合体，将S3构建的子宫内膜类器官模型存在于24孔板的Transwell小室中，上室和下室均有ExM培养基培养0
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4天；后续采用气液界面的特殊培养方式，移去Transwell上室的液体，保持子宫内膜类器官模型上方接触空气，下方接触培养基以获得营养；采用气液界面培养方式培养4
‑
20天。
[0017]进一步的，所述的S5中子宫内膜类器官模型结构和功能验证，体外给予5
‑
15nMβ
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雌二醇(E2)处理3
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8天，气液界面培养分化4
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20天，模拟月经周期的增殖期；给予5
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15nMβ
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雌二醇(E2)处理3
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8天后，再加1μM孕酮(P4)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、体外建立原代子宫内膜上皮类器官和子宫内膜基质细胞系；S2、改善用于组装子宫内膜腺体样类器官与基质细胞的细胞外基质；S3、构建的子宫内膜类器官模型包含腺体和基质细胞；S4、采用气液界面培养子宫内膜类器官模型，使其具有腔上皮和腺体结构；S5、子宫内膜类器官模型模拟子宫内膜的月经周期以及功能鉴定。2.根据权利要求1所述的一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，其特征在于：所述的S1中子宫内膜上皮类器官的培养基被称为扩增培养基(Expansionmedium，ExM)，其中成分包括AdvancedDMEM/F12，N2supplement，B27supplementminus vitaminA，青霉素/链霉素，0.5
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2mMN
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Acetyl
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L
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cysteine，0.5
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3mM L
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glutamine，30
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70ng/mlEGF，50
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200ng/mlNoggin，50
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100ng/ml Rspondin
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1，50
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200ng/mlFGF
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10，20
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80ng/mlHGF，200
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1000nM A83
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01，5
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20nM烟酰胺和5
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15nMY27632。3.根据权利要求1所述的一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，其特征在于：所述的S1中子宫内膜基质细胞的培养基成分为5
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20％胎牛血清和0.5
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5μg/mlL
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ascorbicacid。4.根据权利要求1所述的一种子宫内膜类器官体外构建母胎界面的3D模型制备方法，其特征在于：所述的S2中将子宫内膜腺体样上皮类器官与基质细胞的细胞按照一定比例进行混合；改善组装子宫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天晴，田冀雯，杨洁，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：