诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法技术

本发明专利技术涉及类器官技术领域，公开了一种诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法。含有本发明专利技术提供的组合物的培养基特别适合禽类肠道类器官的制备，而且可以在类器官诱导培养和传代过程(即类器官原代培养和传代培养)中通用，简化了肠道类器官构建的材料选择，降低了实验失误的可能性。本发明专利技术提供的方法具有较高的禽类肠道类器官构建成功率，并且还有流程简单、快速、高效的优点，有效提高实验效率，适合推广应用。适合推广应用。适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】
诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法


[0001]本专利技术涉及类器官
，具体涉及一种诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法。

技术介绍

[0002]类器官体系的构建和发展是近年来干细胞研究领域取得的关键进展之一，其与传统的生物筛选模型，例如细胞模型和动物模型等相比具有明显的优势，既能减少动物模型中存在的其他混淆变量，与单纯的细胞培养物相比又具有一定的复杂性，具有较高水平的生理相关性。从而在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个领域拥有广泛的应用前景。
[0003]家禽肠道健康与其健康程度以及生产能力具有十分密切的联系，肠道状态和功能好的家禽具有较好的免疫力，营养吸收充分，气血旺盛，生产性能好。若家禽发生肠炎等肠道疾病，对其健康具有很多危害，例如造成家禽营养不良，体质差，生产性能下降，抗病力低下，进而导致养殖企业的死淘率高，造成企业效益降低的问题。
[0004]肠道类器官的构建有利于更好地进行肠道疾病的相关研究，例如肠道疾病病原体的研究，肠道疾病发生发展机制的研究，肠道疾病预防和治疗方法的研究以及相关药物开发等。然而，目前虽然对人类肠道类器官构建的研究较多，但是对养殖动物，例如禽类肠道类器官的构建却鲜少有相关报道。这对于养殖业的发展，尤其是家禽饲养和家禽肠道疾病治疗和预防等方面的发展十分不利。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺乏禽类肠道类器官构建相关研究等问题，提供一种诱导干细胞分化的组合物、培养基及其应用和制备禽类肠道类器官的方法。含有本专利技术提供的组合物的培养基特别适合禽类肠道类器官的制备，而且可以在类器官诱导培养和传代过程(即类器官原代培养和传代培养)中通用，减少了现有技术中类器官培养基通常分为诱导培养基和生长培养基等多个种类，容易因失误造成实验失败，浪费材料并提高研究成本的问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种诱导干细胞分化的组合物，所述组合物包括L
‑
谷氨酰胺补充剂、WNT蛋白、牛血清蛋白、烟酰胺和地塞米松。
[0007]本专利技术第二方面提供一种培养基，所述培养基为含有第一方面所述的组合物的Advanced DMEM/F12培养基。
[0008]本专利技术第三方面提供第一方面所述的组合物，或者，第二方面所述的培养基在类器官培养中的应用，尤其是肠道类器官培养中的应用，优选在禽类肠道类器官制备中的应用。
[0009]本专利技术第四方面提供一种制备禽类肠道类器官的方法，所述方法包括将禽类肠道
原代细胞采用Matrigel基质胶包被后置于第二方面所述的培养基中进行诱导培养。
[0010]本专利技术第五方面提供根据第四方面所述的方法制备获得的禽类肠道组织类器官。
[0011]通过上述技术方案，本专利技术至少能够取得如下有益效果：
[0012](1)含有本专利技术提供的组合物的培养基适合肠道类器官的培养，尤其适合禽类肠道类器官培养，为类器官研究领域中禽类肠道类器官的研究提供了基础。
[0013](2)采用含有本专利技术提供的组合物的培养基进行禽类肠道类器官培养的方法具有流程简单、快速、高效的优点，有效提高实验效率。而且，本专利技术提供的方法中，禽类肠道类器官的构建、传代和扩增均采用本专利技术提供的培养基一种培养基即可完成，降低了目前大多数类器官培养方法中因不同阶段需要使用不同培养基从而造成实验失误的可能性。
附图说明
[0014]图1是实施例1中制备获得的雏鸡肠道组织类器官的的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
[0015]图2
‑
4是实施例2中采用不同禽类肠道类器官培养液构建的雏鸡肠道组织类器官的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
[0016]图5和图6分别为实施例3中采用通过不同消化液获得的禽类肠道原代细胞构建的雏鸡肠道组织类器官的形态示意图(图中比例尺为100μm)。
具体实施方式
[0017]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0018]本专利技术的专利技术人在研究中巧妙地发现，在基础培养基(如Advanced DMEM/F12培养基等)中添加特定小分子营养物质时，能够有效诱导禽类干细胞分化为肠道组织细胞，从而构建出禽类肠道类器官。并且该培养基在已构建的肠道类器官的扩培和传代时也能使用，实现了采用同一培养基进行肠道组织类器官的原代和传代培养，极大简化了肠道类器官构建的实验流程，减少了因错用培养基导致的实验失误和材料浪费。
[0019]基于上述发现，本专利技术一方面提供一种诱导干细胞分化的组合物，所述组合物包括L
‑
谷氨酰胺补充剂、WNT蛋白、牛血清蛋白(BSA)、烟酰胺和地塞米松。
[0020]本专利技术中，L
‑
谷氨酰胺补充剂是指能够为培养基提供L
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谷氨酰胺的化合物，例如可以为L
‑
谷氨酰胺，或者也可以是含L
‑
谷氨酰胺的其他化合物或组合物。本专利技术对于采用的L
‑
谷氨酰胺补充剂的具体来源没有特别限制，其既可以是自行制备的相关化合物，也可以是商购获得的相关产品(例如GlutaMAX
TM
等)。
[0021]WNT蛋白是一类高度保守的分泌型糖蛋白家族，是Wnt信号通路的重要蛋白，可作为细胞因子加入培养基中，进行类器官构建。本专利技术对于采用的WNT蛋白没有特别限制，任意能够用于(禽类)肠道类器官构建使用的WNT蛋白均可适用于本专利技术，例如Wnt
‑
3a等。
[0022]地塞米松(Dexamethasone，DXMS)是一种人工合成的皮质类固醇，CAS号为50
‑
02
‑
2。
[0023]为了提高类器官的构建成功率和效果，本专利技术提供的组合物中除含有上述物质外，还可以含有其他的细胞因子或化合物。根据本专利技术的优选实施方式，其中，所述组合物中还含有4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、N2添加剂、B27添加剂、N
‑
乙酰半胱氨酸、R
‑
脊椎蛋白、表皮生长因子、头蛋白、胃泌素I、A83
‑
01、SB202190、Y
‑
27632和抗生素中的至少一种。
[0024]优选地，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B和原代细胞抗生素中的至少一种。
[0025]N2添加剂和B27添加剂都是用于培养基中的无血清添加剂，其可为培养基提供多种营养物质和细胞因子，通常可以通过商购途径获得。购买获得的N2添加剂和B27添加剂通常都以浓缩液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导干细胞分化的组合物，其特征在于，所述组合物包括L
‑
谷氨酰胺补充剂、WNT蛋白、牛血清蛋白、烟酰胺和地塞米松。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中还含有4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、N2添加剂、B27添加剂、N
‑
乙酰半胱氨酸、R
‑
脊椎蛋白、表皮生长因子、头蛋白、胃泌素I、A83
‑
01、SB202190、Y
‑
27632和抗生素中的至少一种，优选所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B和原代细胞抗生素中的至少一种。3.一种培养基，其特征在于，所述培养基为含有权利要求1或2所述的组合物的Advanced DMEM/F 12培养基。4.根据权利要求3所述的培养基，其中，所述培养基中，L
‑
谷氨酰胺补充剂的终浓度为1
‑
3mM，WNT蛋白的终浓度为5
‑
500ng/mL，牛血清蛋白的终浓度为0.5
‑
2重量％，烟酰胺的终浓度为5
‑
15mM，地塞米松的终浓度为5
‑
20μM；优选地，所述培养基中，4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为5
‑
15mM；优选地，所述培养基中，N2添加剂的终浓度为1
×‑2×
；优选地，所述培养基中，B27添加剂的终浓度为1
×‑2×
；优选地，所述培养基中，N
‑
乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5
‑
1.5mM；优选地，所述培养基中，R
‑
脊椎蛋白的终浓度为100
‑
1000ng/mL；优选地，所述培养基中，表皮生长因子的终浓度为10
‑
200ng/mL；优选地，所述培养基中，头蛋白的终浓度为50
‑
200ng/mL；优选地，所述培养基中，Gastrin I的终浓度为5
‑
20nM；优选地，所述培养基中，A83
‑
01的终浓度为0.5
‑
1μM；优选地，所述培养基中，SB202190的终浓度为5
‑
15μM；优选地，所述培养基中，Y27632的终浓度为5
‑
15μM；优选地，所述培养基中，所述抗生素的用量使得青霉素在培养基中的终浓度为100
‑
200U/mL；优选地，所述培养基中，所述抗生素的用量使得链霉素在培养基中的终浓度为0.1
‑
0.2mg/mL；优选地，所述培养基中，所述抗生素的用量使得两性霉素B在培养基中的终浓度为0.25
‑
0.5μg/mL；优选地，所述培养基中，所述抗生素的用量使得原代细胞抗生素在培养基中的终浓度为50
‑
150μg/mL。5.权利要求1或2所述的组合物，或者，权利要求3或4所述的培养基在类器官培养中的应用，尤...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐民，何萌萌，郭志英，宫晓艳，王承志，
申请(专利权)人：北京赛拉达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：