核酸扩增方法和核酸分析用装置制造方法及图纸

提供一种用于在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇的方法和装置。本发明专利技术涉及的方法中，在具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面的基板上，形成封入有作为模板的核酸的液滴，在基板上的液滴内进行核酸扩增反应后，将液滴除去，进一步在基板上进行核酸扩增反应。

Nucleic acid amplification method and apparatus for nucleic acid analysis

The invention provides a method and a device for regularly configuring and forming an amplified nucleic acid fragment cluster without amplification bias on a substrate. In the method of the invention, on a plurality of first surfaces having hydrophilicity and a substrate surrounding each of the said plurality of first surfaces and a second surface having a lower hydrophilicity than the said first surface, a droplet sealed with nucleic acid as a template is formed. After the nucleic acid amplification reaction is carried out in the droplet on the substrate, the droplet is removed and the nucleic acid amplification reaction is further carried out on the substrate \u3002

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸扩增方法和核酸分析用装置
本专利技术涉及基板上的核酸扩增方法和核酸分析用装置。
技术介绍
专利文献1中，作为基板上的核酸扩增方法，记载了可以包括下述步骤的制作生物分子的图形化表面的方法：(a)准备试剂的步骤，该试剂包括(i)在表面不连续、具有被表面的间隔区域分隔的特定点的阵列、以及(ii)含有多种不同的目标生物分子的溶液；以及(b)使试剂反应，将生物分子输送至特定点，使各个生物分子分别附着于各个特定点的步骤，该步骤中对间隔区域施加电场，从间隔区域获取生物分子。专利文献2中记载了作为将核酸等物质封入于基板上的方法而使用容纳部13的底面为亲水性且侧壁12的上表面为疏水性的阵列。因此，在珠子导入工序中使用亲水性的第一溶剂20的情况下，能够更有效地将含有珠子21、21’的第一溶剂20导入容纳部13中，进一步，能够防止珠子容纳工序中使用的疏水性的第二溶剂30进入容纳部13，因而能够使容纳部13内的亲水性的第一溶剂20被疏水性的第二溶剂30被覆而密闭，形成液滴(Droplet)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开WO2013/188582号专利文献2：国际公开WO2016/006208号
技术实现思路
专利技术所要解决的课题并列型测序仪中，为了提高分析的容易性，需要形成在基板上规则地配置、单一分子来源的扩增核酸片段簇的技术。专利文献1中，记载了形成在基板上规则地配置、单一分子来源的扩增核酸片段簇的技术。可是，多个模板的扩增反应是在没有隔离的溶液内进行的，因此存在下述问题：由于模板DNA在基板上附着的速度的差异，先前有助于形成簇的DNA分子在周边基板上成为进一步形成簇的模板，产生扩增偏倚。因此，需要在基板上使各模板在隔离的液体中扩增的技术。另一方面，专利文献2中记载了在基板上规则地配置、将核酸等物质按照液滴进行隔离的技术。可是，没有实现基板上的扩增核酸片段簇的形成，因此必须用另外的装置将形成的扩增核酸片段簇配置在基板上。本专利技术的目的在于，提供在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇的技术。用于解决课题的方法为了解决上述课题，本专利技术提供一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：准备基板的工序，前述基板具有以任意的规则性配置的有亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面，在前述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子，在前述基板上供应含有前述作为模板的核酸的试样溶液与含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的混合溶液，在前述第一表面上配置前述混合溶液，前述作为模板的核酸结合在与前述作为模板的核酸特异性结合的分子上的工序，在前述基板上供应疏水性溶剂，形成封入有配置在前述第一表面上的前述混合溶液的液滴的工序，在前述液滴内进行前述核酸的扩增反应的工序，从前述基板上将前述疏水性溶剂除去的工序，在前述基板上供应含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的工序，以及进行前述核酸的扩增反应的工序。此外，为了解决上述课题，本专利技术还提供一种核酸分析用装置，其特征在于，具备进行核酸扩增反应的反应容器、容纳含有作为模板的核酸的试样溶液的试样溶液槽、容纳疏水性溶剂的疏水性溶剂槽、以及容纳至少含有核酸扩增底物的反应溶液的反应溶液槽，前述反应容器中设有能够与前述试样溶液槽、前述疏水性溶剂槽和前述反应溶液槽连接的第一开口部和第二开口部，在前述反应容器内的上表面或者底面中的任一者设有基板，前述基板具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面，在前述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子。专利技术的效果根据本专利技术，能够在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇。因此，能够实现并列型测序仪中有效且高精度的核酸扩增和之后的核酸分析。附图说明图1为实施例1的核酸分析用装置的构成图。图2A中，(a)为示出实施例1的具有亲水性图形区域的基板的例子的图。(b)为示出实施例1的具有亲水性图形区域的基板的例子的横截面的图。图2B为示出实施例1的核酸分析用装置中亲水性图形区域的具体实施方式的图。图3示出实施例1的核酸扩增方法的各工序的概要图。图4示出实施例2的核酸扩增方法的各工序的概要图。图5示出实施例1或2的核酸扩增方法的结果的概念图。图6示出实施例3的核酸扩增方法的各工序的概要图。图7示出实施例3的核酸扩增方法的结果的概念图。图8示出实施例4的核酸扩增方法的各工序的概要图。图9为实施例5中的核酸分析用装置的构成图。图10示出实施例5的核酸扩增方法的各工序的概要图。图11示出实施例5的核酸扩增方法的流程图。图12示出实施例5的核酸扩增方法的流程图。图13为进行实施例6中的DNA测序的情况中的核酸分析用装置的构成图。具体实施方式以下，使用附图对实施例进行说明，但本专利技术不限定于这些实施例。实施例1图1为用于实施本实施例中的核酸扩增方法的核酸分析用装置的一个例子的构成图。作为进行核酸扩增反应的反应容器的流动池100在其底面设有基板102，前述基板102具有：以任意的规则性配置的有亲水性的多个第一表面，以及围绕各个前述多个第一表面且亲水性比第一表面低的第二表面。以下将第一表面称为亲水性图形区域101。其中，基板102也可以设于流动池100内的上表面。流动池100上具备第一开口部104和第二开口部105，可以通过第一开口部104和第二开口部105实现任意液体向流动池100内的供应和从流动池100的排出。将该液体流经的区域称为流动池溶液槽103。试样溶液槽106、疏水性溶剂槽107和反应溶液槽108通过各阀门110对第一开口部104进行连接。此外，排液槽109通过阀门110对第二开口部105进行连接。利用各阀门110的开闭，能够实现对流动池100内的液体供应和排出的控制。这里，试样溶液槽106所容纳的试样溶液是含有作为模板的核酸的溶液。作为模板的核酸可以为双链，也可以为单链，还可以为DNA或RNA、或者杂交核酸。反应溶液槽108所容纳的反应溶液例如是含有核酸合成酶、核酸扩增底物等的溶液。疏水性溶剂槽107所容纳的疏水性溶剂是在与试样溶液、反应溶液混合时分为2层的溶剂，优选在试样溶液、反应溶液中溶解性低，具有高排斥性。此外，基板102可以根据在流动池100的上表面或者下表面的设置形态的改变，来选择疏水性溶剂相对于试样溶液和反应溶液的比重。例如可以使用脂肪族烃(烷烃、环烷烃、角鲨烯等)、芳香族烃(苯、甲苯等)、硅油、石蜡油、氟利昂液体(FluorinertFC-40等)等。其中，也可以根据向流动池100供应的液体的种类，增加所连接的开口部或增加连接于开口部的液槽。此外，通过在第一开口部104和第二开口部105中的至少一方或两方设置泵112，能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：/n准备基板的工序，所述基板具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个所述多个第一表面且亲水性比所述第一表面低的第二表面，在所述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子，/n在所述基板上供应含有所述作为模板的核酸的试样溶液与含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的混合溶液，在所述第一表面上配置所述混合溶液，所述作为模板的核酸结合在与所述作为模板的核酸特异性结合的分子上的工序，/n在所述基板上供应疏水性溶剂，形成封入有配置在所述第一表面上的所述混合溶液的液滴的工序，/n在所述液滴内进行所述核酸的扩增反应的工序，/n从所述基板上将所述疏水性溶剂除去的工序，/n在所述基板上供应含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的工序，以及/n进行所述核酸的扩增反应的工序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：
准备基板的工序，所述基板具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个所述多个第一表面且亲水性比所述第一表面低的第二表面，在所述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子，
在所述基板上供应含有所述作为模板的核酸的试样溶液与含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的混合溶液，在所述第一表面上配置所述混合溶液，所述作为模板的核酸结合在与所述作为模板的核酸特异性结合的分子上的工序，
在所述基板上供应疏水性溶剂，形成封入有配置在所述第一表面上的所述混合溶液的液滴的工序，
在所述液滴内进行所述核酸的扩增反应的工序，
从所述基板上将所述疏水性溶剂除去的工序，
在所述基板上供应含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的工序，以及
进行所述核酸的扩增反应的工序。


2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，所述扩增反应为滚环扩增即RCA或者聚合酶链反应即PCR。


3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，将含有所述作为模板的核酸的试样溶液稀释，形成每1个所述液滴封入有1分子以下所述作为模板的核酸的液滴。


4.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，所述核酸选自由信使RNA即mRNA、非编码RNA即ncRNA、微小RNA、基因组DNA、和它们的片段、以及RNA与DNA的杂交核酸组成的组。


5.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，在所述液滴内进行所述核酸的扩增反应的工序后，进一步包括：
在所述基板上供应含有所述作为模板的核酸的试样溶液与含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的混合溶液，在所述第一表面中不含扩增得到的核酸片段的第一表面上配置所述混合溶液，所述作为模板的核酸结合在与所述作为模板的核酸特异性结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：横井崇秀，植松千宗，板桥直志，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：日本;JP