腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体制造技术

本发明专利技术提供了：腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体，当与野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比时，其在PLA2结构域中含有至少一个氨基酸置换，并且所述氨基酸置换发生至少一个选自以下位置：AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中的(1)在位置‑3处的丙氨酸残基，(2)在位置‑6处的酪氨酸残基，(3)在位置‑68处的丙氨酸残基，(4)在位置‑87处的天冬氨酸残基，(5)在位置‑91处的亮氨酸残基，(6)在位置‑149处的丝氨酸残基，(7)在位置‑150处的脯氨酸残基和(8)在位置‑156处的丝氨酸残基，或除了AAV2以外的AAV的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中的选自对应于上述位置(1)至(8)的位置的至少一个位置；编码所述突变体的核酸；含有所述核酸的细胞；用于产生重组AAV颗粒的方法，其包括培养所述细胞以产生重组AAV颗粒的步骤；含有所述突变体的重组AAV颗粒；含有所述重组AAV颗粒的组合物；和用于将基因转移至靶细胞中的方法，其包括使所述重组AAV颗粒与靶细胞接触的步骤。

Mutation of capsid protein of adeno-associated virus (AAV)

The invention provides a mutant of AAV capsid protein, when compared with the amino acid sequence of wild AAV capsid protein, it contains at least one amino acid replacement in PLA2 domain, and the amino acid replacement occurs at least one amino acid residue selected from the following positions: (1) alanine residue at position \u2011 3, (2) position in AAV2 VP1 capsid protein amino acid sequence Tyrosine residue at \u2011 6, (3) alanine residue at \u2011 68, (4) aspartic acid residue at \u2011 87, (5) leucine residue at \u2011 91, (6) serine residue at \u2011 149, (7) proline residue at \u2011 150 and (8) serine residue at \u2011 156, or amino acid sequence of VP1 capsid protein of AAV other than AAV2 Selected from at least one position corresponding to positions (1) to (8) above; nucleic acid encoding the mutant; cell containing the nucleic acid; method for producing recombinant AAV particles, including the step of culturing the cell to produce recombinant AAV particles; recombinant AAV particles containing the mutant; composition containing the recombinant AAV particles; and for transferring genes to the target A method in a cell includes a step of contacting the recombinant AAV particles with a target cell.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体
本专利技术涉及腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体。本专利技术的AAV衣壳蛋白突变体尤其可用于基因转移至靶细胞中和/或在靶细胞中表达转基因。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是一种感染哺乳动物诸如人和灵长类动物的直径为约20nm的无包膜病毒，并且被分类为家族细小病毒科，依赖病毒属。迄今为止，已经鉴定了大量AAV血清型(例如，非专利文献1)，并且已知不同血清型的AAV感染不同类型的动物或细胞。AAV基因组是近似4.7kb的单链DNA(ssDNA)，并且在两个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)。ITR序列自身形成Watson-Crick碱基对以形成T型发夹结构，其包含AAV基因组的复制和包装所必需的顺式元件。AAV基因组在侧接ITR序列的区域中包含两个开放阅读框(ORF)。一个ORF(也称为“rep基因”)编码四种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)。另一个ORF(也称为“cap基因”)编码三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)和组装活化蛋白(AAP)。Rep蛋白具有解旋酶活性，并且不仅是诱导外壳形成所需的，而且是将AAV基因组整合至宿主细胞染色体中所需的。另一方面，VP1、VP2和VP3的总共60个分子以1:1:10的比率组装以形成二十面体AAV外壳。VP1、VP2和VP3主要在N-末端区域中不同。例如，磷脂酶A2(磷脂酶A2:PLA2)结构域存在于VP1的N-末端。由于PLA2结构域仅存在于VP1中，所以VP1的N-末端区域也称为VP1独特区域(VP1u)。已知PLA2结构域在酸性条件下暴露于AAV颗粒外部（尽管其通常存在于AAV颗粒内侧）。因此，据信PLA2结构域是AAV在AAV进入细胞后从内体逃逸并转移至核中所必需的(非专利文献2)。AAP是形成AAV衣壳所必需的蛋白。天然的AAV复制取决于辅助病毒诸如腺病毒和疱疹病毒的存在。在辅助病毒存在的情况下，AAV基因组在宿主细胞中复制，并形成含有AAV基因组的完整AAV颗粒。然后，AAV颗粒从宿主细胞释放。在辅助病毒不存在的情况下，AAV基因组以附加体形式维持，或整合至宿主染色体中并变得潜伏。AAV可以感染各种各样的细胞，包括人细胞，并且AAV甚至感染分化终止的非分裂中的细胞，包括血细胞、肌肉细胞和神经细胞。此外，由于AAV对人无致病性，所以其具有副作用的低风险。AAV的病毒颗粒在物理化学上是稳定的。由于这些原因，AAV最近已受到作为用于基因疗法中的基因转移的载体的实用价值的关注，所述基因疗法用于治疗先天性遗传疾病以及治疗癌症或感染。遗传修饰的AAV(下文称为重组AAV)的产生通常通过如下进行：以核酸构建体的形式将形成AAV颗粒所必需的元件引入细胞中以产生具有产生病毒的能力的细胞(下文称为产生病毒的细胞)，和培养细胞以表达AAV颗粒形成所必需的元件。通常，在AAV颗粒形成所必需的元件中，需要以顺式提供的元件和可以以反式提供的元件分别作为分开的构建体引入细胞中，由此防止野生型AAV的产生和重组AAV在宿主中的自我复制。通常，通过将如下所述的三种类型的质粒引入细胞中来产生产生病毒的细胞。1)用于提供重组AAV基因组的质粒，其在两个末端保留ITR序列，从其中除去rep和cap基因，并且其携带期望的异源多核苷酸(有时称为转基因)代替除去的rep和cap基因(下文称为载体质粒)；2)用于提供Rep蛋白和衣壳蛋白的质粒(下文称为包装质粒)；和3)用于在腺病毒来源的元件中仅提供AAV颗粒形成所必需的元件的质粒(下文称为辅助质粒)。使用装载有期望的异源多核苷酸的重组AAV颗粒使得能够将长期稳定的基因转移至各种靶细胞或靶器官中。迄今为止，已经显示基因转移至骨骼肌细胞、肝细胞(肝脏)、心肌细胞(心脏)、神经细胞、胰腺细胞和胰岛细胞中是可能的。此外，重组AAV已用于人临床试验中。另一方面，通过改变衣壳蛋白来进行改变AAV的细胞向性(专利文献1)或增加基因转移效率(例如，专利文献2和专利文献3)的尝试。例如，专利文献2公开了通过用另一种氨基酸置换AAV的外壳表面上存在的抗原残基以避免中和抗体除去AAV颗粒，AAV在活体中的长期存活变得可能，并且作为结果，基因转移效率增加。专利文献3公开了通过用另一种氨基酸(例如，苯丙氨酸)置换AAV的外壳表面上存在的酪氨酸残基来抑制细胞中酪氨酸的泛素化和避免泛素-蛋白酶体水解，AAV在活体中的长期存活变得可能，并且作为结果，基因转移效率增加。引文列表专利文献专利文献1：WO2014/103957专利文献2：WO2014/194132专利文献3：WO2008/124724非专利文献非专利文献1：Vandenberghe等人,HumanGeneTherapy,Vol.21,pp.1251-1257,2010非专利文献2：Kronenberg等人,JournalofVirology,Vol.79,pp.5296-5303,2005。专利技术概述技术问题如上所述，曾经尝试通过改变AAV衣壳蛋白来增加基因转移效率。然而，通过使用重组AAV增加基因转移效率和/或基因表达效率的此类尝试仍有改进的空间。具体地，用AAV感染靶细胞和转基因的表达通过多个步骤完成。因此，预期通过改进每个步骤可以协同地增加基因转移效率和/或基因表达效率。本专利技术的一个目的是提供AAV衣壳蛋白的突变体，以便通过使用重组AAV增加基因转移至靶细胞中的效率和/或增加基因表达的效率。问题的解决方案作为解决上述问题的大量努力的结果，本专利技术人发现可以通过利用AAV衣壳蛋白的新型突变体以高效率将期望的基因引入靶细胞，并且可以在细胞中强烈表达该基因。因此，完成了本专利技术。具体地，本专利技术涉及：[1]腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体，与野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，其在PLA2结构域中包含一个或多个氨基酸置换，其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自以下的一个或多个位置：在AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)在位置3处的丙氨酸，(2)在位置6处的酪氨酸，(3)在位置68处的丙氨酸，(4)在位置87处的天冬氨酸，(5)在位置91处的亮氨酸，(6)在位置149处的丝氨酸，(7)在位置150处的脯氨酸，和(8)在位置156处的丝氨酸，或在除了AAV2以外的AAV的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中对应于上述(1)至(8)的一个或多个位置处；[2]根据[1]所述的AAV衣壳蛋白的突变体，其中所述一个或多个氨基酸置换是选自以下的一个或多个氨基酸置换：在AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(A3T)，(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(Y6H)，(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(A68V)，(4)用天冬酰胺置换位置87处的天冬氨酸(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体，与野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，其在PLA2结构域中包含一个或多个氨基酸置换，/n其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自以下的一个或多个位置：/n在AAV2 VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中/n(1)在位置3处的丙氨酸，/n(2)在位置6处的酪氨酸，/n(3)在位置68处的丙氨酸，/n(4)在位置87处的天冬氨酸，/n(5)在位置91处的亮氨酸，/n(6)在位置149处的丝氨酸，/n(7)在位置150处的脯氨酸，和/n(8)在位置156处的丝氨酸，/n或除了AAV2以外的AAV的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应于上述(1)至(8)的一个或多个位置。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170130 JP 2017-0143771.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的突变体，与野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，其在PLA2结构域中包含一个或多个氨基酸置换，
其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自以下的一个或多个位置：
在AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中
(1)在位置3处的丙氨酸，
(2)在位置6处的酪氨酸，
(3)在位置68处的丙氨酸，
(4)在位置87处的天冬氨酸，
(5)在位置91处的亮氨酸，
(6)在位置149处的丝氨酸，
(7)在位置150处的脯氨酸，和
(8)在位置156处的丝氨酸，
或除了AAV2以外的AAV的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中的对应于上述(1)至(8)的一个或多个位置。


2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白的突变体，其中所述一个或多个氨基酸置换是选自以下的一个或多个氨基酸置换：
在AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸序列中的
(1)用苏氨酸置换位置3处的丙氨酸(A3T)，
(2)用组氨酸置换位置6处的酪氨酸(Y6H)，
(3)用缬氨酸置换位置68处的丙氨酸(A68V)，
(4)用天冬酰胺置换位置87处的天冬氨酸(D87N)，
(5)用脯氨酸置换位置91处的的亮氨酸(L91P)，
(6)用酪氨酸置换位置149处的丝氨酸(S149Y)，
(7)用组氨酸置换位置150处的脯氨酸(P150H)，和
(8)用酪氨酸置换位置156处的丝氨酸(S156Y)，
或除了AAV2以外的AAV的VP1衣壳蛋白的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈田尚巳，冈田浩典，喜纳裕美，榎龙嗣，西江敏和，峰野纯一，
申请(专利权)人：学校法人日本医科大学，国立研究开发法人国立精神·神经医疗研究中心，宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP