本发明专利技术涉及一种氟罗沙星单链抗体关键多肽序列及其应用，属于抗菌药物抗原检测领域。本发明专利技术借助于分子对接及虚拟筛选技术，在氟罗沙星单链抗体晶体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，其多肽序列为ADYYHSKNYWY和RTTYYLDS。通过ELISA结合试验结果表明，氟罗沙星单链抗体能够与相应靶标抗原有良好的结合能力，由此证明，借助本发明专利技术设计而成的多肽，可用于对氟罗沙星抗原进行定量和定性的快速检测。
Sequence and application of key peptide of single chain antibody of fleroxacin
The invention relates to a key polypeptide sequence of single chain antibody of fleroxacin and its application, belonging to the field of antigen detection of antibacterial drugs. With the help of molecular docking and virtual screening technology, on the basis of the crystal structure of fleroxacin single chain antibody, through molecular docking technology, the invention searches for the peptide ligand with the best binding mode and affinity with the target protein in the virtual peptide library, and the peptide sequence is adyyhsknywy and rttyylds. The results of ELISA showed that the single chain antibody of fleroxacin has a good binding ability with the corresponding target antigen. Therefore, the polypeptide designed by the invention can be used for quantitative and qualitative rapid detection of fleroxacin antigen.
【技术实现步骤摘要】
氟罗沙星单链抗体关键多肽序列及应用
本专利技术涉及一种氟罗沙星单链抗体序列及应用，属于抗菌药物抗原检测领域。
技术介绍
利用噬菌体展示技术筛选氟喹诺酮类抗菌药物的特异性单链抗体，不依赖细胞融合和动物免疫就可以得到抗体，表达纯化后ELISA鉴定抑制效果，试验周期短。通过与Internet网上的NCBIDNA数据库相联，用SWISS-MODEL软件对scFv基因序列进行同源建模，分析其结构。基于分子对接的虚拟筛选技术是一种新兴的研究多肽与蛋白质之间相互作用的技术手段。该技术主要是运用计算机快速运算实现多肽与相应靶标蛋白在空间构象上的对接，将虚拟多肽数据库中的分子逐一与靶标蛋白晶体结构的特定活性位点进行对接，通过计算机快速运算并不断调整多肽与靶标蛋白结合的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和靶标蛋白的氨基酸残基侧链和骨架，寻找多肽分子与靶标蛋白在空间结构上的最佳构象，并预测两者之间的结合模式与亲和力，通过评分值挑选出接近天然构象的与靶标蛋白亲和力最佳的多肽配体的一种理论模拟分子间相互作用的方法。氟罗沙星是一类化学合成的第三代喹诺酮类抗菌药，是小分子化合物，属于半抗原，将其与蛋白质载体进行偶联后，再制备成完全抗原，即指小分子物质必须和载体蛋白偶联之后方能刺激机体产生特异性的抗体，并包被于固相载体上用于ELISA检测。该药物具有抗菌谱广、抗菌力强、作用迅速、吸收完全、毒作用小和不易产生耐药等特点；随着氟罗沙星的广泛应用，在动物源性食品中的残留将对人类身体健康产生非常大的危害，已引起广泛关注，有必要进一步对其加强监测。国际上常用的氟罗沙星药残的检测方法主要有：高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等。这些方法虽然灵敏、准确，但检测时间长、耗资大，对人员素质要求高，不适合对大批量样品测定，不适应快速、简便的市场监测要求。
技术实现思路
本专利技术借助于分子对接及虚拟筛选技术，在氟罗沙星单链抗体晶体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，其多肽序列为ADYYHSKNYWY和RTTYYLDS。通过ELISA结合试验结果表明，氟罗沙星单链抗体能够与相应靶标抗原有良好的结合能力，由此证明，借助本专利技术设计而成的多肽，可用于对氟罗沙星抗原进行定量和定性的快速检测。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种氟罗沙星单链抗体关键多肽序列为：SEQIDNO.1：ADYYHSKNYWY和SEQIDNO.2：RTTYYLDS。所述的氟罗沙星单链抗体关键多肽序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不限制于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。所述的氟罗沙星单链抗体关键多肽序列在氟罗沙星抗原鉴定中的应用。所述的多肽序列在氟罗沙星抗原的快速检测中的应用。所述快速检测包括但不局限于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。所述的多肽序列在对氟罗沙星抗原进行定量和定性检测中的应用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术借助于分子对接及虚拟筛选技术，在氟罗沙星单链抗体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，最终得到特异性结合氟罗沙星抗原的多肽序列，其多肽序列为ADYYHSKNYWY(SEQIDNO.1)和RTTYYLDS(SEQIDNO.2)。经与氟罗沙星抗原进行亲和力鉴定，表明亲和力较好。2、由于纯化技术的局限性，针对氟罗沙星的抗体获得很难，本专利技术设计得到的序列很好地避免了这一难题，能实现快速的人工合成，检测成本低廉。3、本专利技术设计而成的序列具有较好的特异性。4、本专利技术通过计算机辅助实施分子对接，可为实现氟罗沙星单链抗体结构功能解析提供较好的理论指导。5、本专利技术通过对筛选序列进行标记，可实现对氟罗沙星抗原进行定性和定量的快速检测，具有操作简单、省时省力和费用低等优点。6、本实验不需要依赖细胞融合或经动物免疫就能得到亲和力高的抗体，检测成本低廉，更为便捷高效。附图说明图1为重链(VH)、轻链(VL)基因的扩增琼脂糖凝胶电泳结果；图中M指Marker，VH指重链基因片段，大小约340bp，VL1、VL2、VL3、VL4指轻链基因片段，大小约320bp。图2为氟罗沙星FLE在大肠杆菌中的表达结果；图2中，蛋白表达进行超声破碎后沉淀中表达量较高，上清表达量少。上清进行纯化后，洗脱液中的目的蛋白量较少。洗脱液1为100mM咪唑洗脱下的蛋白，洗脱液2为200mM咪唑洗脱下的蛋白，洗脱液3为250mM咪唑洗脱下的蛋白。超微量紫外分光光度计检测蛋白浓度分别为13.62mg/mL、2.28mg/mL、2.09mg/mL。图3为FLE-scFv同源建模的最佳模板(上图)和建模结果(下图)。具体实施方式实施例1：运用pCANTAB5e系统展示重组抗体建库及淘筛一、脾细胞总RNA提取1、颈椎脱臼法处死小鼠(未免疫的BALB/c小鼠)，将小鼠浸泡在75％(V/V)的酒精中10分钟，取出后将其置于白板上仰卧暴露腹部，放入超净工作台内，用灭菌剪刀开腹，用镊子取出脾脏。将脾脏放入盛有10mL灭菌的0.02M磷酸盐(PBS)缓冲液的平皿中，剥去周围脂肪组织，洗涤外表面，再放入盛有10mL灭菌的0.02MPBS缓冲液的平皿中漂洗1次，彻底洗去脾脏表面游离的脂肪细胞。2、将脾脏置于灭菌后的尼龙网上，剪碎，用10mL灭菌的0.15MPBS缓冲液冲洗，边冲边用剪刀研磨。根据组织剩余量再加10mL灭菌的0.15MPBS缓冲液，使脾细胞全部通过网孔流入小烧杯中。3、取下网袋，吹打均匀平皿内脾细胞悬液，将其转移到50mL离心管中。4、4℃1000rpm离心10分钟，舍弃上清液。5、沉淀细胞再用10mL灭菌的0.15MPBS缓冲液重悬离心洗涤一次。舍弃上清液，余离心管底部少量细胞悬液。6、分离脾细胞后，以TRIzol法进行RNA提取，产物进行紫外分光光度计检测，浓度为39.33ng/μL，OD值260/280为1.787，OD值260/230为2.035，说明提取的RNA纯度较高。二、小鼠轻链(VL)、重链(VH)基因的扩增与鉴定以所得总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，使用VL、VH引物扩增全套抗体基因；扩增所用引物见表1；反应条件如下：94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段。结果见图1。所用引物见表1。表1.引物序列表注：表中VHfor中下划线处为SfiI酶切位点，VLback中下划线处为NotI酶切位点；VHback及VLfor中下划线部分为(Gly4Ser)3序列；序列中简并碱基符号为W＝A/T；S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.氟罗沙星单链抗体关键多肽序列，其特征在于，所述的多肽序列为SEQ ID NO.1：ADYYHSKNYWY和SEQ ID NO.2：RTTYYLDS。/n
【技术特征摘要】
1.氟罗沙星单链抗体关键多肽序列，其特征在于，所述的多肽序列为SEQIDNO.1：ADYYHSKNYWY和SEQIDNO.2：RTTYYLDS。
2.根据权利要求1所述的氟罗沙星单链抗体关键多肽序列，其特征在于，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不限制于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
3....
【专利技术属性】
技术研发人员：王方雨，张改平，刘运超，郭振华，杜加茹，郝俊芳，柴书军，邓瑞广，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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