用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。基于上述特征性肽段定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，包括以下步骤：通过液相色谱‑质谱联用法或QconCAT法对用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测。本发明专利技术提供的特征性肽段序列能够实现同时、高效、灵敏、准确且可重复地对FPGS与GGH进行绝对定量分析，进而实现临床中MTX精准给药的临床指导。

Characteristic peptide segments for the detection of FPGS and GGH protein expression and their application

The invention discloses a characteristic peptide segment for FPGS and GGH protein expression amount detection and its application. The sequence of the characteristic peptide segment for FPGS protein expression amount detection is sglqvedldr; the sequence of the characteristic peptide segment for GGH protein expression amount detection is ylesagar. The method for quantitative detection of FPGS and GGH protein expression based on the above characteristic peptide segments includes the following steps: quantitative detection of the characteristic peptide segments used for the detection of FPGS protein expression and the characteristic peptide segments used for the detection of GGH protein expression by liquid chromatography-mass spectrometry or qconcat method, so as to achieve the quantitative detection of FPGS and GGH protein expression. The characteristic peptide sequence provided by the invention can realize the absolute quantitative analysis of FPGS and GGH simultaneously, efficiently, sensitively, accurately and repeatedly, so as to realize the clinical guidance for the accurate administration of MTX in clinical.

【技术实现步骤摘要】
用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用
本专利技术涉及检测
，具体涉及用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用。
技术介绍
叶酰多聚谷氨合成酶(Folypolyglutamatesyn-thetase，FPGS)与谷氨酰水解酶(Gamma-glutamylhydrolase，GGH)介导甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)在效应细胞内的多聚谷氨酸化过程与去谷氨酸化过程。多聚谷氨酸甲氨蝶呤(Methotrexatepolyglutamate，MTXPGs)自身无法出胞，易在胞内蓄积，可长时间作用于靶点，因此，MTX的细胞毒作用的强弱主要取决于细胞内MTXPGs浓度。FPGS与GGH介导的代谢作用存在平衡状态，这导致在相同给药剂量下，由于FPGS与GGH的代谢作用达到平衡，快速输注(高血液浓度)和慢速输注(低血液浓度)两种环境下的胞内MTXPGs的净生成速率差别不大。因此，慢速输注时，血液中MTX的暴露时间长，胞内MTXPGs蓄积作用更强，MTXPGs浓度更高，其产生的副作用更强。快慢速输注下副作用发生情况与临床用药的普遍规律相反，需要在临床用药过程中格外关注，即通过监测FPGS与GGH指导临床使用MTX。但目前对于FPGS与GGH的分析主要停留在酶活性的测定层面，该方式过程复杂、耗时长且结果可重复性较差，导致不同批次间及实验室间的分析结果可比性弱，分析结果无法被广泛应用。有研究报道表明FPGS与GGH的酶活性与其表达量成正比，虽有研究者对二者的表达量进行了研究分析，但其采取的分析手段主要包括逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)和蛋白质印迹法(WesternBlot)，其中，RT-PCR从mRNA水平进行分析，由于多种因素的影响，如转录后修饰，蛋白质与mRNA的半衰期不同等，mRNA水平与翻译水平无法对等，且蛋白质才是发挥生理作用的最终形式，因此RT-PCR无法实现准确的分析；而WesternBlot虽然从蛋白质表达层面进行分析，但是其灵敏度较低，无法对细胞间FPGS与GGH表达量的微量区别进行辨别，根本无法指导临床用药；其次，FPGS与GGH属于内源性蛋白，与其他内源性蛋白间具有一定的序列同源性，可能伴有一定的抗原-抗体交叉反应，进而导致定量结果出错。因此，该种检测方法仅能进行定性或半定量研究且结果可重复性较低，目前临床中还未能实现以定量监测FPGS与GGH进而为临床指导提供帮助。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是：提供一种能够实现FPGS和GGH蛋白表达量定量分析且可重现性好的特征性肽段。本专利技术所要解决的第二个技术问题是：提供一种上述特征性肽段在FPGS和GGH蛋白表达量定量分析中的应用。为了解决上述第一个技术问题，本专利技术采用的技术方案为：用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段，其中，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案提供的特征性肽段序列能够实现同时、高效、灵敏、准确且可重复地对FPGS与GGH进行绝对定量分析，进而实现临床中MTX精准给药的临床指导。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，包括以下步骤：取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或定量肽段串联体法(Quantificationconcatamers，QconCAT)对样本溶液中用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测，所述用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。进一步地，通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；分别取定量的用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段标准品配制成标准工作液；S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述特征性肽段进行定量检测。优选地，所述液相色谱-质谱联用仪为超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UltraHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry，UPLC-MS/MS)。进一步地，所述步骤S2中的检测过程中，色谱条件包括：以含有0.1％甲酸(Formicacid，FA)的水溶液为A流动相，以含有0.1％甲酸(Formicacid，FA)的水溶液为B流动相，按照以下洗脱程序进行洗脱分离：0min，A：95％1min，A：95％3min，A：40％4min，A：40％5min，A：95％。进一步地，色谱条件还包括：色谱柱为C18柱，流速：0.2mL·min-1，柱温：60℃；进样量：5μL。进一步地，检测过程中，质谱条件包括序列为SGLQVEDLDR肽段母离子m/z:[M+2H]2+566.3，子离子m/z:746.4；序列为YLESAGAR肽段母离子m/z:[M+2H]2+433.7，子离子m/z:590.3，其中，母离子均可存在±5Da的差值。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案以特征性肽段为目标分子量，利用液相色谱与质谱联用仪对特征性肽段进行检测，进而实现目标蛋白的定量检测，操作简便且可重现性好。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术采用的技术方案还可以为：一种基于上述特征性肽段定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的试剂盒，所述试剂盒包括用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品、用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于蛋白质酶解试剂。进一步地，所述用于蛋白质酶解的试剂包括还原剂、烷基化试剂及蛋白酶。进一步地，所述还原剂为二硫苏糖醇，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述蛋白酶为胰蛋白酶。进一步地，所述试剂盒还包括细胞提取及裂解试剂。本专利技术的有益效果在于：将特征性肽段的处理试剂制备成试剂盒，使得操作更为简便。附图说明图1为本专利技术实施例1中FPGS特征性肽段BLAST验证结果图；图2为本专利技术实施例1中GGH特征性肽段BLAST验证结果图；图3为本专利技术实施例1中FPGS特征性肽段的定量工作曲线；图4为本专利技术实施例1中GGH特征性肽段的定量工作曲线。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术实施例1为：用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用，其中，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段，其特征在于：用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。/n

【技术特征摘要】
1.用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段，其特征在于：用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。


2.一种定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，包括以下步骤：其特征在于：
取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或QconCAT法对样本溶液中用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测，所述用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。


3.根据权利要求2所述的特征性肽段定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，其特征在于：通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：
S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；分别取定量的用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段标准品配制成标准工作液；
S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述特征性肽段进行定量检测。


4.根据权利要求3所述的定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪为UPLC-MS/MS。


5.根据权利要求3所述的定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，其特征在于：所述步骤S2中的检测过程中，色谱条件包括：以含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：余鹏，蒋蕾，孟凡奇，丁尧，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43