靶向型杀蚊毒素制造技术

本文所述的杀虫毒素是由与毒素结构域融合的靶向结构域组成的融合毒素肽。该靶向肽通过使融合毒素肽以导致杀虫活性的方式结合蚊产生与蚊的特异性结合。本文所述的转基因植物通过在花蜜中表达杀虫毒素蛋白而杀蚊，所述杀虫毒素蛋白包括靶向肽以确保对蚊的特异性。这些转基因植物是安全性的榜样，因为它们是非农作物植物并且对一个蚊的种具有特异性。

Targeted mosquito killing toxin

The insecticidal toxin described in this paper is a fusion toxin peptide composed of a target domain fused with the toxin domain. The target peptide binds to mosquito by making the fusion toxin peptide lead to insecticidal activity. The transgenic plants described in this paper kill mosquitoes by expressing insecticidal toxin protein in nectar, and the insecticidal toxin protein includes targeted peptide to ensure the specificity to mosquitoes. These transgenic plants are an example of safety because they are non crop plants and are specific to a species of mosquito.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向型杀蚊毒素
技术介绍
本申请要求于2017年4月4日提交的标题为“靶向型杀蚊毒素”的美国临时专利申请No.62/481,199的优先权，其全部内容通过援引加入合并于此。本专利技术涉及靶向型杀蚊毒素和经改造以产生杀蚊毒素从而控制蚊种群的植物。蚊是被最普遍不喜欢的害虫之一。除了它们常见的令人讨厌的因素，它们还是许多致命和破坏性疾病的携带者。蚊传播的疾病每年在全球造成数百万人死亡，特别是在发展中国家。疫苗仅在一定比例的病毒性疾病中开发成功。每隔十年，新病原体的出现都会加剧这些困难，例如当前的寨卡病和基孔肯雅病的威胁。控制蚊种群的努力包括旨在去除死水的局域性努力，以及总体而广泛的杀虫剂喷洒。这些努力并未显示出巨大的成功，并且在喷洒杀虫剂的情况下，对非靶标物种产生了负面影响。杀虫剂计划一直是美国控蚊的主要手段，但杀虫剂可能会带来生态后果，如2016年在南卡罗来纳州响应于寨卡病毒威胁进行的杀虫剂处理所导致的大规模蜜蜂杀伤中所见。驱蚊剂在有限的情况下有效，但是，对于日常生活(尤其是家庭)而言，可能无法遵循每天使用驱蚊剂的原则。即使采用现有的蚊虫控制措施，美国的许多公民还是在夏天只是呆在室内，以避免疾病传播的风险以及蚊的烦扰。
技术实现思路
本专利技术涉及对蚊有毒但对非靶标昆虫种类无毒的靶向型杀虫蛋白。本专利技术还涉及经改造以产生毒素的植物。在具体的实施方案中，所述转基因植物表达杀虫毒素蛋白，其包含靶向肽以确保对蚊的特异性。杀虫毒素可以在植物生成的花蜜中产生。这些植物代表了一种生态敏感，具有成本效益且长期的方法，该方法利用了蚊的种群对花蜜摄食的关键性要求。蚊种群严重依赖花蜜作为食物来源。雄性使用花蜜和其他糖源作为唯一的营养来源，而雌性则依靠它来为其寻血飞行提供能量，从而为越冬和其他目的做准备。利用这一事实，已证明掺有杀虫剂的糖饵是控蚊的可行措施。但是，最好避免完全使用杀虫剂。适当的且有效的杀蚊肽递送机制将使生物安全控蚊策略成为可能。已经制备了针对特定生物体的毒性肽。使用靶向肽已经改变了抗微生物肽的特异性，并且已经在大肠杆菌中以高产率产生了融合体。已经产生了对金黄色葡萄球菌和变形链球菌具有特异性毒性的化学合成融合肽。此外，显示出表达靶向型融合肽的转基因植物对镰刀菌根腐真菌和蚜虫具有特异性抗性。本
技术实现思路
涉及具有融合在一起的对蚊特异的靶向肽和毒素肽的靶向型融合肽。该靶向肽确保融合肽仅被蚊以某种诱导毒素毒性的方式吸食或结合。除非以这种方式吸食或结合所述融合肽，否则该毒素肽将没有毒性。因此，将所述的肽靶向蚊会产生对非蚊昆虫无作用的毒素。靶向型融合肽可以在包括酵母或大肠杆菌的任何合适的生物体中表达，然后被提取、分离或纯化，以用作杀蚊毒素。在一些实施方案中，将植物改造成以确保蚊子吸食、消耗、暴露于或以其他方式摄取该肽的方式来生产所述靶向型融合肽。在一些实施方案中，改造花蜜植物以在花蜜中表达所述的靶向型融合肽。花蜜是蚊子生命周期的重要组成部分，对它们非常有吸引力。雄性蚊子依靠花蜜或提供的糖源来维持生存，而雌性蚊子则需要花蜜来驱动他们的寻血飞行。非花蜜植物也可以被改造以表达靶向型融合肽，条件是它以允许蚊消耗或吸食所述肽毒素的方式表达。本专利技术还涉及产生靶向融合肽的转基因杀蚊植物。在一些优选的实施方案中，所述植物是花蜜植物，但是它们可以是任何合适的植物，包括树木和灌木。可以被改造为转基因杀蚊植物的优选花蜜植物包括常见的园林凤仙花(gardenimpatiens)植物，该植物在整个潮湿的热带地区都不需要维护就可以生长，而且还是世界上最畅销的商业化铺垫植物。研究表明，凤仙花(尤其是非洲凤仙花(Impatienswalleriana))在吸引蚊子、花蜜蛋白产量和被基因转化的能力方面表现优异。在优选的实施方案中，凤仙花植物被改造成仅在花蜜中表达毒素，该毒素对蜜蜂无毒，但在室外园林试验中有效控制蚊子。这些转基因植物是安全性的榜样，因为它们是非农作物植物，特异于一种害虫种类，并且可以被改造为没有能力将毒素转基因传播到周围的生态系统。在优选的实施方案中，将外源遗传构建体用于表达靶向型毒素肽以进行分离和纯化，或将植物转化为转基因杀蚊植物。该构建体优选地包括不同的方面。利用植物特异性启动子，例如凤仙花蜜启动子。从所述构建体表达杀虫毒素肽。还表达了将与毒素肽形成肽融合体的靶向肽，优选地通过特异性结合例如与消化道上皮的结合来靶向蚊。靶向型毒素对具有抗蚊毒性，但对非靶标昆虫种类无毒。这些特征实现了毒素肽的杀蚊方面。杀蚊的花蜜植物价格便宜，高度可扩大化，在生态上安全，几乎不需要维护。这项技术能够在数十年中为非常大的区域同时提供蚊虫控制。附图说明图1显示了用于通过大肠杆菌表达非靶向型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的构建体。图2显示了用于通过大肠杆菌表达靶向伊蚊的EGFP的构建体。图3示出了使用靶向型和非靶向型EGFP在埃及伊蚊中的荧光测定的结果。图4显示了用于通过大肠杆菌表达非靶向型Hv1a杀虫毒素的构建体。图5显示了用于通过大肠杆菌表达靶向伊蚊的Hv1a杀虫毒素的构建体。图6显示口服给予靶向型毒素和非靶向型毒素后埃及伊蚊存活曲线的比较。图7显示了使用靶向伊蚊的EGFP和非靶向型EGFP在致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)中进行荧光测定结果。图8显示口服给予靶向伊蚊的毒素和非靶向型毒素后致倦库蚊存活曲线的比较。具体实施方式的详细描述本专利技术涉及靶向型毒素肽，其对蚊有毒而对其他非靶标物种无毒。本专利技术还涉及表达编码蚊特异性毒素的外源基因的杀蚊植物。在优选的实施方案中，本专利技术涉及靶向蚊的毒素。所述毒素是由与毒素结构域融合的靶向型结构域组成的融合毒素肽。所述靶向肽产生与蚊的特异性结合，例如通过使所述融合毒素肽以诱导毒性的方式结合蚊。在优选的实施方案中，所述靶向肽特异性地靶向蚊的属或种。有三个具体的蚊的种与疾病传播最相关：埃及伊蚊(Aedesaegypti)，其携带黄热病、寨卡病毒、基孔肯雅热、登革热和脑炎；冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)，其携带疟疾；以及库蚊(Culex)属的各个种，其携带西尼罗河病毒、脑炎和丝虫病。在一个优选的实施方案中，所述靶向肽被设计成靶向埃及伊蚊。登革病毒糖蛋白的结构域III已显示为活性结构，可使登革病毒颗粒与蚊子消化道上皮细胞结合，从而使病毒成功进入所述细胞内(Hrobowski(2005)VirologyJournal2:49)。在一个优选的实施方案中，来自登革病毒糖蛋白的结构域III的肽用于将杀虫肽靶向埃及伊蚊的消化道。使用这种靶向蛋白将融合的毒素肽特异地针对蚊子的消化道将会导致毒素对蚊子是致死的，但而不会影响蜜蜂和其他授粉媒介。在进一步的优选实施方案中，所述靶向肽具有以下序列：MIGVEPGQLKLNWFKK(SEQIDNO:1)。在另外的优选实施方案中，所述靶向型结构域可以源自寨卡(Zika)病毒或西尼罗(WestNile)病毒的结构域III的序列。可以将所述靶向型结构域设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杀蚊毒素，包括：/n融合毒素肽，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170404 US 62/481,1991.一种杀蚊毒素，包括：
融合毒素肽，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性。


2.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽靶向伊蚊、按蚊或库蚊。


3.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽靶向埃及伊蚊。


4.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽结合埃及伊蚊的消化道上皮。


5.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽是衍生自黄病毒结构域III的肽。


6.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽是衍生自登革病毒糖蛋白结构域III的肽。


7.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是具有抗蚊毒性的肽。


8.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是在不与所述蚊靶向肽融合的情况下没有抗蚊毒性的肽。


9.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是Hv1a蜘蛛毒素肽。


10.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述融合毒素肽对其他生物体没有毒性。


11.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其进一步包含载体。


12.一种生产表达杀蚊毒素的修饰植物的方法，包括：
诱导编码融合毒素肽的外源基因构建体在所述植物的靶细胞中表达，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性；和
产生表达所述融合毒素肽的修饰植物。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述植物是花蜜植物，所述植物的靶细胞是产花蜜细胞，并且所述修饰植物在该植物的花蜜中表达所述融合毒素肽。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物是非洲凤仙花。


15.根据权利要求12所述的方法，其中所述蚊靶向肽靶向伊蚊，按蚊或库蚊。


16.根据权利要求12所述的方法，其中所述蚊靶向肽靶向埃及伊蚊。


17.根据权利要求12所述的方法，其中所述蚊靶向肽结合埃及伊蚊的消化道上皮。


18.根据权利要求12所述的方法，其中所述蚊靶向肽是衍生自黄病毒结构域III的肽。


19.根据权利要求12所述的方法，其中所述蚊靶向肽是衍生自登革病毒糖蛋白结构域III的肽。


20.根据权利要求12所述的方法，其中所述毒素肽是具有抗蚊毒性的肽。


21.根据权利要求12所述的方法，其中所述毒素肽是在不与所述蚊靶向肽融合的情况下没有抗蚊毒性的肽。


22.根据权利要求12所述的方法，其中所述毒素肽是Hv1a蜘蛛毒素肽。


23.根据权利要求12所述的方法，其中所述融合毒素肽没有对其他生物体的毒性。


24.根据权利要求12所述的方法，其中所述外源基因构建体包含对所述植物特异的启动子，编码所述蚊靶向肽的基因和编码所述毒素肽的基因。


25.根据权利要求12所述的方法，其中诱导所述外源基因构建体表达的步骤包括用该外源基因构建体转化所述植物的至少一个细胞以产生表达所述融合毒素肽的修饰植物。

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·卡尼，G·普鲁厄特，
申请(专利权)人：贝勒大学，
类型：发明
国别省市：美国;US