The invention relates to an artificial molecular complex comprising at least one site-specific nuclease and at least one repair template docking domain which directly interacts with it, and the repair template docking domain interacts with at least one repair template nucleic acid sequence. The artificial complex may further comprise at least one interaction domain. Artificial molecular complexes are configured to mediate the repair of DNA target sequences in prokaryotic or eukaryotic or viral organisms or genomes in a targeted manner with high precision, and therefore can be used for genome engineering of prokaryotic or eukaryotic cells or organisms or for genome engineering of prokaryotic, eukaryotic or viral genomes in vivo or in vitro. Methods for modifying at least one DNA target sequence in a prokaryotic or eukaryotic cell or virus genome, for example, for character development or for disease treatment, are also provided. In addition, a method is provided for the preparation of plants, plant cells, plant materials or derivatives or their descendants including or edited by at least one artificial molecular complex.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组工程的与核酸内切酶相连的修复模板
本专利技术涉及人工分子复合物，其包含至少一个位点特异性核酸酶以及与其直接相互作用的至少一个修复模板对接结构域，所述修复模板对接结构域与至少一个修复模板核酸序列相互作用。人工复合物可进一步包含至少一个相互作用结构域。人工分子复合物被配置为以靶向的方式高精度地介导原核或真核或病毒生物或基因组中DNA靶序列的修复，并因此可用于原核或真核细胞或生物体的基因组工程或在体内或体外用于原核、真核或病毒基因组中的基因组工程。还提供了例如用于性状开发或用于治疗疾病的修饰原核或真核细胞或病毒基因组中的至少一个DNA靶序列的方法。另外，提供了制备包含至少一个人工分子复合物或由至少一个人工分子复合物编辑的植物、植物细胞、植物材料或衍生物或其后代的方法。这里因此提供了适用于任何位点特异性核酸酶的人工分子复合物，所述人工分子复合物指导修复模板与待修饰的DNA靶序列紧密物理接近以允许在诱导的DNA双链断裂的位点处现成可用的原位修复模板以保证各种基因组工程方法的高效率和可预测性。专利技术背景精准的基因编辑或基因组工程已经发展成为遗传工程最重要的领域之一，可以对目标基因组进行靶向和定点操纵。定点基因组工程的一个必不可少的先决条件是可编程的核酸酶，它可以用来在指定的位置断裂感兴趣的核酸以诱导双链断裂(DSB)或一个或多个单链断裂。或者，所述核酸酶可以是嵌合或突变的变体，不再包含核酸酶功能，而是作为识别分子与另一种酶组合。因此那些核酸酶或其变体对于任何基因编辑或基因组工程方法都是关键的。近年来，已经开发了许...
【技术保护点】
1.一种人工分子复合物，包括/n(a)至少一个位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段，或编码其的核酸序列，并且直接与(b)相互作用/n(b)至少一个修复模板对接结构域(RTDD)或编码其的核酸序列，其中所述修复模板对接结构域被配置为直接与至少一个修复模板核酸序列(RT)相互作用；/n(c)任选地包含至少一个相互作用结构域(IA)或编码其的核酸序列，其中所述至少一个相互作用结构域与所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段直接相互作用，并且其中所述至少一个相互作用结构域被配置为提供选自由以下组成的组的至少一种功能：/n(i)与所述至少一个修复模板对接结合域相互作用；和/或/n(ii)与所述至少一个修复模板核酸序列相互作用；和/或/n(iii)与基因组DNA序列特异性相互作用；/n其中所述至少一个修复模板核酸序列包含至少一个与至少一个基因组互补序列互补的部分，并且其中所述至少一个修复模板核酸序列配置成介导DNA靶序列的修复。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170130 US 62/451,8591.一种人工分子复合物，包括
(a)至少一个位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段，或编码其的核酸序列，并且直接与(b)相互作用
(b)至少一个修复模板对接结构域(RTDD)或编码其的核酸序列，其中所述修复模板对接结构域被配置为直接与至少一个修复模板核酸序列(RT)相互作用；
(c)任选地包含至少一个相互作用结构域(IA)或编码其的核酸序列，其中所述至少一个相互作用结构域与所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段直接相互作用，并且其中所述至少一个相互作用结构域被配置为提供选自由以下组成的组的至少一种功能：
(i)与所述至少一个修复模板对接结合域相互作用；和/或
(ii)与所述至少一个修复模板核酸序列相互作用；和/或
(iii)与基因组DNA序列特异性相互作用；
其中所述至少一个修复模板核酸序列包含至少一个与至少一个基因组互补序列互补的部分，并且其中所述至少一个修复模板核酸序列配置成介导DNA靶序列的修复。
2.根据权利要求1的人工分子复合物，其中所述位点特异性核酸酶或编码其的核酸序列选自以下至少一种：CRISPR核酸酶，包括Cas或Cpf1核酸酶；TALEN；ZFN；大范围核酸酶；限制性核酸内切酶，包括FokI或其变体；或两种位点特异性切口核酸内切酶；或其变体或催化活性片段。
3.根据权利要求1或2中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个修复模板对接结构域或编码其的核酸序列选自以下至少一个：生物素；适体；DNA、RNA或蛋白质染料，包括荧光团，包含荧光素，或其变体，马来酰亚胺或四氮唑(XTT)；特异性配置为与至少一个修复模板核酸序列相互作用的向导核酸序列；链霉抗生物素蛋白或其变体，优选单体抗生物素蛋白；抗生物素蛋白或其变体；亲和标签，优选链霉抗生物素蛋白标签；抗体；单链可变片段(scFv)；单域抗体(纳米抗体)；抗运载蛋白；农杆菌VirD2蛋白或其结构域；小核糖核酸病毒VPg；拓扑异构酶或其结构域；PhiX174噬菌体A蛋白；PhiXA*蛋白；VirE2蛋白或其结构域；或地高辛。
4.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个相互作用结构域或编码其的核酸序列选自以下至少一种：DNA结合结构域；链霉抗生物素蛋白或其变体，优选单体链霉抗生物素蛋白；抗生物素蛋白或其变体；亲和标签；生物素化信号；生物素受体位点；链霉抗生物素蛋白标签；抗体；单链可变片段(scFv)；单结构域抗体(纳米抗体)；抗运载蛋白；生物素；适体；DNA、RNA或蛋白质染料，包括荧光团，包含荧光素，或其变体，马来酰亚胺或四氮唑(XTT))；特异性配置为与所述至少一个修复模板核酸序列相互作用的向导核酸序列；农杆菌VirD2蛋白或其结构域；小核糖核酸病毒VPg；拓扑异构酶或其结构域；PhiX174噬菌体A蛋白；PhiXA*蛋白；VirE2蛋白或其结构域；或地高辛。
5.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个位点特异性核酸酶和/或所述至少一个修复模板核酸序列和/或所述至少一个相互作用结构域包含至少一个核定位序列、质体定位序列，优选线粒体定位序列或叶绿体定位序列。
6.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个修复模板核酸序列包含至少一个末端部分，优选3'末端，其中该末端部分不与所述人工分子复合物的任何其他组分相互作用，并因此配置成与至少一个基因组互补序列杂交以介导所述DNA靶序列的修复，和/或其中所述至少一个修复模板核酸序列作为质粒提供。
7.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段或编码其的序列选自CRISPR核酸酶，优选选自Cas或Cpf1核酸酶，或FokI核酸酶，或其催化片段，且所述至少一个相互作用结构域或编码其的序列选自单链可变片段或单体链霉抗生物素蛋白。
8.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述复合物包含至少一个代表所述至少一个修复模板对接结构域的向导核酸序列，其中所述至少一个向导核酸序列中的每一个包含
(i)第一序列部分，其与识别DNA靶序列互补，和
(ii)第二序列部分，其中所述第二序列部分被配置为与所述至少一个位点特异性核酸酶相互作用，和
(iii)其中所述至少一个向导核酸序列与所述至少一个修复模板核酸序列物理缔合，并因此形成包含至少一个RNA或DNA和至少一个其他DNA核酸序列的杂交核酸序列或由至少一个RNA或DNA和至少一个其他DNA核酸序列组成的杂交核酸序列，和
(iv)任选地包含在所述至少一个向导核酸序列和所述至少一个修复模板核酸序列之间的接头区域，
优选其中所述修复模板核酸序列在所述向导核酸序列的3'末端与所述向导核酸序列缔合，和/或其中所述修复模板核酸序列与所述向导核酸序列的5'末端缔合，和/或其中所述修复模板核酸序列位于所述向导核酸序列内。
9.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个修复模板核酸序列和/或所述至少一个向导核酸序列包括核苷酸序列，所述核苷酸序列选自天然或非天然存在核苷酸序列，包含合成核苷酸序列，任选地包括主链和/或碱基修饰，其中所述向导核酸序列包括单链或部分单链的RNA或DNA核苷酸序列，且其中所述至少一个修复模板核酸序列包括单链或双链DNA核苷酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个位点特异性核酸酶或编码其的序列，和所述至少一个相互作用结构域或编码其的序列，和/或所述至少一个修复模板对接结构域或编码其的序列通过至少一个接头结构域连接。
11.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段或编码其的序列独立地选自由以下组成的组：来自以下的Cas多肽：链球菌属(Streptococcusspp.)包括化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，或奈瑟菌属(Neisseriaspp.)包括脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)，棒杆菌(Corynebacter)，萨特氏菌(Sutterella)，军团菌(Legionella)，密螺旋体(Treponema)，产线菌(Filifactor)，真细菌(Eubacterium)，乳酸菌(Lactobacillus)，支原体(Mycoplasma)，拟杆菌(Bacteroides)，Flaviivola，黄杆菌(Flavobacterium)，Sphaerochaeta，固氮螺菌(Azospirillum)，葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)，罗氏菌(Roseburia)，细小棒菌(Parvibaculum)，硝酸盐裂解菌(Nitratifractor)，支原体和弯曲杆菌(Campylobacter)，CandidatusMicrarchaeumacidiphilumARMAN-1，俭菌总门细菌(Parcubacteria)(GenBank:APG80656.1)，硫化叶菌属(Sulfolobusspp.)，包括冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)HVE10/4(GenBank:ADX81770.1)或REY15A(GenBank:ADX84852.1)；来自古细菌或细菌的Cpf1多肽，包括来自以下的Cpf1多肽：氨基酸球菌属(Acidaminococcusspp.)包括氨基酸球菌属BV3L6，毛螺菌(Lachnospiraceaespp.)包括毛螺菌ND2006、毛螺菌MC2017、毛螺菌MA2020，瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)，Candidatusspp.，Methanoplasmatermitum，稻田钩端螺旋体(Leptospirainadai)，牛眼莫拉菌(Moraxellabovoculi)237，异域菌门细菌(Peregrinibacteriabacterium)GW2011_GWA2_33_10，俭菌总门细菌(Parcubacteriabacterium)GW2011_GWC2_44_17，史密斯氏菌属(Smithellasp.)SCADC，史密斯氏菌属SC_K08D17，弗朗西斯氏菌(Francisellaspp.)包括新凶手弗朗西丝氏菌(Francisellanovicida)U112，挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)，普氏菌(Prevotellaspp.)或卟啉单胞菌(Porphyromonasspp.)；或来自以下的Argonaute核酸酶：格氏黄杆菌(GenBank：AFZ73749.1)，铜绿...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·拉布斯，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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