引导性抗微生物肽的益生菌递送制造技术

本公开涉及对抗所选择的肠道中的细菌(例如幽门螺杆菌(H.pylori))的治疗策略。该策略使用基于益生菌(probiotic

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引导性抗微生物肽的益生菌递送
[0001]背景
[0002]本公开涉及消除特定肠道菌种(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))而不改变微生物群系(microbiome)的方法。
[0003]肠道微生物群以多种方式影响人类健康。肠道微生物群系含有100+万亿个细菌，并且主要参与介导宿主的免疫应答，同时还执行其他基本功能，包括从食物中提取营养和能量。肠道的细菌构成使人们易出现健康问题，范围从肥胖到癌症再到心理障碍。对微生物群系的破坏(失调)导致包含人的正常保护性微生物群落(mircoflora)在内的细菌类型和数量的不平衡。有许多因素导致失调，包括摄入病原菌和抗生素介导或免疫抑制介导的微生物群系耗竭。失调与许多人类疾病有关，包括肠道以及肠道外疾病。文献表明，失调牵涉IBS即炎症性肠病和结直肠癌以及过敏、心血管疾病和精神疾病的发病机理。另外，鉴于在无病菌动物模型中已显示疾病的严重程度和/或发病率降低，因此肠道微生物群(microbiota)被认为是自身免疫性疾病的前兆。
[0004]在其他情况下，肠道细菌的变化是由于摄入可能产生肠病的危险病原体所致。几乎没有(若有)已被报道的有效消除作为活跃病原体或作为使人易患各种疾患的微生物群系的参与者导致肠道问题的特定菌种的方法。
[0005]幽门螺杆菌是一种肠道细菌，其是导致消化性溃疡和胃癌的主要原因。在癌症中胃癌导致的死亡人数居全球第三，且在远东地区尤为常见(Bahkti等人，2020)。仅有1/5的胃癌患者在诊断后活得过5年。幽门螺杆菌被国际癌症研究机构认定为第1类致癌物。据估计，有44亿人感染幽门螺杆菌，其中发展中国家的感染率最高(非洲的患病率为70％)(Hooi等人，2017)。在美国，幽门螺杆菌在非白人人群中的发生频率是白人人群的两倍(Everhart等人，2000)，并且与全世界较低的社会经济状态有关。
[0006]尚没有针对幽门螺杆菌的商业疫苗。尽管在一些使用抗生素治疗的国家，在降低幽门螺杆菌患病率方面取得了一些进展，但现在在幽门螺杆菌分离株中发现抗生素耐药率大幅增加。在韩国，幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率在仅4年(2005
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2009年)内从11％升高至60％，中国和日本也报道了类似的增长(Thung等人，2016)。尽管标准治疗实际上是三联抗生素疗法，但抗生素耐药率继续上升。因此，很难看到通过抗生素治疗幽门螺杆菌的前景。其他细菌也面临类似的挑战。
[0007]概述
[0008]本公开涉及对抗所选择的肠道中的细菌(例如幽门螺杆菌)的治疗策略。该策略使用基于益生菌的系统表达引导性抗微生物肽和将引导性抗微生物肽递送至肠道。该引导性抗微生物肽由益生菌DNA中的杂合基因表达，并且可以是与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，该引导肽负责与靶细菌的蛋白结合。融合可以在有或没有接头序列即不依赖于接头序列的存在的情况下进行。该技术可以从肠道微生物群中选择性地且特异性地消除靶细菌。在株、种或属水平上的靶向特异性取决于用于提供靶向的引导肽的序列。治疗可以通过口服施用，例如通过使用可摄取的益生素。
[0009]本文所述的优选实施方案涉及用于控制靶细菌例如幽门螺杆菌的方法，该方法不
包括抗生素。为了递送活性蛋白，该方法使用工程化益生菌。优选实施方案利用乳酸菌，包括乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)的种，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，它们是食品级细菌，对于人类食用具有安全性或已被FDA授予GRAS状态(公认安全)，并且广泛商业地用于加工乳制品。益生素是一项被充分认可的技术，其价格低廉、高度可扩展且在商业上非常成功。这些商业特性使这项技术特别适合大规模应用，特别是在发展中国家。
[0010]益生菌可以被配制为益生素市场上常见的被认可食品，例如干酸奶颗粒，其无需冷藏即可储存数月。以这种形式，前往国外的旅行者或长期移居国外的人员或士兵可以与食物一起服用该产品，可能每周两次，作为疾病预防剂(“预防性”)。这种治疗也可以作为患者生病后食用的疗方。
[0011]这项技术是重要且有利的，因为它利用的引导性抗微生物肽仅消除靶细菌而微生物群落的所有其他成员不受干扰。使用被摄入并在消化系统中保持有活性以直接在患者肠道中分泌引导性重组抗微生物肽的益生菌也与先前的技术极为不同。
附图说明
[0012]图1显示了用于在大肠杆菌BL21细胞中表达的携带AMP的pE
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SUMOstar载体。SUMO蛋白酶位点位于SUMO和A12C
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AMP之间。
[0013]图2显示了SUMO/AMP在大肠杆菌中的表达和AMP的切割(使其)不含SUMO融合配偶体)。
[0014]图3显示了针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的eurocin和假黑盘菌素(plectasin)的非靶向和靶向类似物的最小抑制浓度(MIC)(以μM计)的对数值。
[0015]图4显示了枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(顺时针)的细胞动力学曲线，通过对细菌在每种肽存在下生长的log CFU/ml作图创建。
[0016]图5显示了对于4种细菌(枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)，通过相对于4种AMP的浓度对结晶紫(540nm)的吸光度作图评价的生物膜抑制活性。
[0017]图6显示了对反向管饲法(reverse gavage)的胃提取物的PCR分析结果，证明摄入后三天，小鼠胃中存在携带空载体、具有抗微生物肽的载体以及具有抗微生物肽和来自多聚蛋白的引导肽的载体的乳酸乳球菌。
[0018]图7显示了根据本文描述的优选实施方案的用于转化乳酸乳球菌的载体。
[0019]图8显示了大肠杆菌在不同抗生素稀释液以及分泌抗微生物肽与引导肽或分泌抗微生物肽但不分泌引导肽的乳酸乳球菌肉汤培养物上清液的存在下的存活率。
[0020]图9显示了用于乳酸乳球菌分泌AMP和gAMP的示例性载体。
[0021]图10显示了对VacA基因的qPCR结果，显示通过在体外与表达gAMP或AMP的乳酸乳球菌(L.lactis)共培养消除了幽门螺杆菌。
[0022]图11显示了与表达空载体(pTKR)、AMP(alyteserin、laterosporulin或CRAMP)或gAMP(MM1
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alyteserin、MM1
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laterosporulin或MM1
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CRAMP)的乳酸乳球菌共培养24小时后植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的生长。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的靶细菌引起的病症的益生素，包含：益生菌，其中所述益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码所述引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，所述引导肽与所述靶细菌的蛋白结合，其中所述引导性抗微生物肽杀死所述受试者的胃肠道中的所述靶细菌，并且其中在与非引导性抗微生物肽或抗生素相比时，所述引导性抗微生物肽最低限度地破坏所述受试者的胃肠道中存在的其他细菌。2.根据权利要求1所述的益生素，其中所述益生菌包含乳酸菌。3.根据权利要求2所述的益生素，其中所述乳酸菌包含乳球菌属(Lactococcus)的细菌。4.根据权利要求3所述的益生素，其中所述乳球菌属的细菌包含乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。5.根据权利要求1所述的益生素，其中所述靶细菌的蛋白是毒力因子。6.根据权利要求5所述的益生素，其中所述毒力因子是VacA肽。7.根据权利要求1所述的益生素，其中所述抗微生物肽是laterosporulin、alyteserin或cathelin相关的抗微生物肽。8.根据权利要求1所述的益生素，其中所述靶细菌包含幽门螺杆菌(H.pylori)。9.根据权利要求1所述的益生素，其中所述引导肽具有包含SEQ ID NO:5的序列。10.根据权利要求1所述的益生素，其中所述抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的序列。11.根据权利要求1所述的益生素，其中所述引导性抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的序列。12.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的靶细菌引起的病症的益生素组合物，包含：权利要求1所述的益生素；和可接受的赋形剂或载体。13.根据权利要求1所述的益生素组合物，其中所述益生菌是可食用的，并且其中所述可接受的赋形剂或载体是可食用的。14.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存在的靶细菌引起的患者的病症的方法，包括：向所述受试者施用益生素组合物，其中所述益生素组合物包含益生菌和可接受的赋形剂或载体，其中所述益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码所述引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，所述引导肽与所述靶细菌的蛋白结合；以及允许所述引导性抗微生物肽杀死所述受试者的胃...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：贝勒大学，
类型：发明
国别省市：