本发明专利技术公开了一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，属于微生物技术领域。本发明专利技术将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以pET‑28a为载体构建重组质粒pET‑28a‑SPase，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌，发酵产重组蔗糖磷酸化酶，并通过紫外诱变法对构建好的重组菌进行诱变，筛选出高产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌菌株，其发酵胞内破壁上清酶活为819.16U/mL，比酶活为206.91U/mg，其稳定的产酶性可以为进一步的理论研究和实际生产应用打下基础，实践应用意义重大。
An Escherichia coli producing sucrose phosphorylase
The invention discloses an E. coli producing sucrose phosphorylase, which belongs to the technical field of microorganism. In the invention, the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1 is used to construct the recombinant plasmid pet-28a-spase with pET-28a as the carrier, which is transformed into E The enzyme activity of the broken wall supernatant is 819.16u/ml, and the specific enzyme activity is 206.91u/mg. Its stable enzyme production can lay a foundation for further theoretical research and practical production and application, which is of great significance in practice.
【技术实现步骤摘要】
一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌
本专利技术涉及一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，属于微生物
技术介绍
蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7，Sucrosephosphorylase，以下简称SPase)主要能够催化两种类型反应：一种是以磷酸化的葡萄糖当作供体转移到不同的物质，如以D-果糖为受体合成蔗糖；另外的一种催化方式是把蔗糖磷酸化酶分解蔗糖得到的葡萄糖基转移至不同类型的受体，如无机磷酸，含酚羟基、醇羟基及羧基的物质，催化合成多种糖苷。蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌中。根据文献报道该酶主要存在于肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides、变异链球菌Stococcusmutans、嗜糖假单胞菌Pseudomonassaccharophila、长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum、青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis等微生物中。Leuconostocmescnteroides可以合成蔗糖磷酸化酶[GoedlC.,SchwarzA.,MinainA.,etal.RecombinantsucrosephosphorylasefromLeuconostocmesenteroides:Characterization,kineticstudiesoftransglucosylation,andapplicationofimmobilisedenzymeforproductionofd-glucose1-phosphate[J].JournalofBiotechnol,2007,129(1):77-86.]。目前，蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌微生物中，植物细胞中有少量分布，该酶主要通过生物发酵获得，野生型菌株中的复杂代谢调控机制使得蔗糖磷酸化酶的产量较低，仅通过野生型菌株发酵生产蔗糖磷酸化酶，难以满足工业应用的要求。目前，在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中异源表达蔗糖磷酸化酶均有文献报道，但存在表达量不高，酶活力不高等问题。因此，提供一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，对于蔗糖磷酸化酶的工业生产具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一株大肠杆菌(Escherichiacoli)，分类命名为EscherichiacoliSPL0224，已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019389，保藏地址为中国武汉，武汉大学。本专利技术的第二个目的是提供含有上述大肠杆菌SPL0224的微生物制剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数不低于106CFU/g或106CFU/mL的大肠杆菌SPL0224细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌细胞包括大肠杆菌SPL0224干菌体或湿菌体。本专利技术的第三个目的是提供一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，是利用上述大肠杆菌SPL0224进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，以TB培养基为发酵培养基。在本专利技术的一种实施方式中，将大肠杆菌SPL0224单菌落接种于LB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养8-12h后，按1-5％接种量接入到TB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD600达到0.5-0.7后，加入IPTG诱导剂于23-27℃，200-220r/min诱导20-30h后收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，将大肠杆菌SPL0224单菌落接种于含Kana的LB液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，按1％接种量接入到含Kana的TB液体培养基中，于37℃，200r/min培养至菌密度OD600达到0.6后，加入IPTG诱导剂于25℃，200r/min诱导24h后收集菌液。将菌液于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机中离心15min，收集菌体。菌体用50mmol/LK2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH6.5)洗两次后收集菌体。将收集好的湿菌体加入50mmol/LK2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH6.5)缓冲液制成菌悬液，放在冰上并固定好，然后用超声波破碎菌体。超声波破碎仪工作时间：2s，间歇时间：4s，总时间：30min。将破碎后的液体于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机下离心30min收集上清即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。本专利技术的第四个目的是提供上述大肠杆菌SPL0224在生产α-熊果苷或含α-熊果苷的产品中的应用，是以蔗糖和氢醌为底物，以大肠杆菌SPL0224为生物催化剂。本专利技术的第五个目的是提供上述大肠杆菌SPL0224在生产1-磷酸葡萄糖或含1-磷酸葡萄糖的产品中的应用。本专利技术的第六个目的是提供上述大肠杆菌SPL0224在生产D-果糖或含D-果糖的产品中的应用。本专利技术的第七个目的是提供上述大肠杆菌SPL0224在食品、化妆品或制药领域中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，以pET-28a为载体构建重组质粒pET-28a-SPase，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌，发酵产重组蔗糖磷酸化酶，并通过紫外诱变法对构建好的重组菌进行诱变，筛选出高产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌菌株，其发酵胞内破壁上清酶活为819.16U/mL，比酶活为206.91U/mg，其稳定的产酶性可以为进一步的理论研究和实际生产应用打下基础，实践应用意义重大。生物材料保藏一株大肠杆菌(Escherichiacoli)，分类命名为EscherichiacoliSPL022，已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019389，保藏地址为中国武汉，武汉大学。附图说明图1为重组菌EscherichiacoliSPL0224摇瓶发酵胞内破壁上清SDS-PAGE电泳图，第1泳道为marker，第2泳道为空载菌摇瓶发酵胞内破壁上清，第3、4泳道为重组菌摇瓶发酵胞内破壁上清，可以清楚的看到图中55KDa处有明显的条带与蔗糖磷酸化酶一致，表明可以获得蔗糖磷酸化酶。具体实施方式实施例1EscherichiacoliSPL02基因工程菌的构建(1)基因的优化：来源于LeuconostocmesenteroidesATCC12291的Sucrosephosphorylase(GenBankAccessionNO.D90314)进行分析优化，获得SEQIDNO.1所示基因序列，并将两个酶切位点NcoI、XhoI加到经过优化后的蔗糖磷酸化酶两端，经过合成得到SPase基因。(2)基因工程菌的构建：将合成的SPase基因和pET-28a载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，酶切后产物用SolutionI连接，然后将重组载体pET-28a-SPase转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株大肠杆菌(Escherichia coli)SPL0224，已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019389，保藏地址为中国武汉，武汉大学。/n
【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌(Escherichiacoli)SPL0224，已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019389，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.含有权利要求1所述的大肠杆菌SPL0224的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有活菌数不低于106CFU/g或106CFU/mL的大肠杆菌SPL0224细胞。
4.一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的大肠杆菌SPL0224进行发酵。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以TB培养基为发酵培养基。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将大肠杆菌SPL0224单菌落接种于LB液体培养基中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈献忠，李晓玉，沈微，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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