一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法技术

本发明专利技术涉及生物制药和微生物培养技术领域，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。CRM197菌种培养基为液体培养基，每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。该培养基在制备时能使得各组分快速溶解，保证培养基的均一性。本申请中CRM197菌种的发酵培养方法采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、成本低、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。

A CRM197 culture medium, preparation method and fermentation culture method

The invention relates to the technical field of biopharmaceutical and microbial culture, in particular to a CRM197 bacterial culture medium, a preparation method and a fermentation culture method. CRM197 culture medium is a liquid medium, each liter of which contains the following components: 250ml basic nutrient solution, 7.2ml acetic acid, 30g maltose monohydrate, 2ml sodium lactate, 0.5g tyrosine, 1.96g potassium dihydrogen phosphate, 5.1g potassium dihydrogen phosphate, 6.13ml growth factor A, 8ml growth factor B, 8ml growth factor C and 1.3g calcium chloride. The preparation of the medium can make each component dissolve quickly and ensure the homogeneity of the medium. The fermentation culture method of CRM197 strain in the application adopts the step-by-step amplification mode of fermentation culture, which is fast, convenient, low-cost and efficient, and is convenient for large-scale expansion of CRM197 strain, so as to obtain high expression of fermentation broth.

【技术实现步骤摘要】
一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法
本专利技术涉及生物制药和微生物培养
，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。
技术介绍
白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素，其以单一多肽的形式产生，且该多肽易于被剪接，在190、192或193残基处裂解，结果形成由二硫键连接的两个亚基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264：15709-15713，1989)。A片段为催化活性部分，是依赖NAD的ADP-核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白质合成因子EF-2，从而使EF-2失活，细胞中的蛋白质则合成停止。CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等NatureNewBiology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单碱基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer1977，AnnRev，Biochem.46；69-94，RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560-564)。由于没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，因此是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。目前，我国公布的有关生产CRM197的方法专利有：2006年03月21日，国家知识产权局公布了葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司P·M·H·德霍泰等用于生产白喉类毒素的方法专利，专利申请号为200680017793.1，此专利涉及CRM197的发酵方法，包括在发酵罐中的培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵方式以及培养基的配方，该培养方式足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的pO2在大部分发酵过程中能够降低到4％以下，直至完成发酵。2007年07月18日，国家知识产权局公布了海南天源康泽医药科技有限公司李模孝等白喉毒素突变体CRM197及其制备方法专利，专利申请号为200610042194.7，此专利以大肠杆菌为出发菌，以包涵体形式表达白喉毒素突变体CRM197，目标产物序列为长度536个氨基酸，具有白喉毒素的免疫原性而不具有白喉毒素的毒性。该专利技术克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上，CRM197更易于纯化，纯度易于达到95％以上，目的蛋白回收率高。然而，无论是天然的CRM197菌种还是重组构建的CRM197工程菌，在实际的菌种发酵过程中，培养方式是制约其高量产的重要一环。因此，研发出一种恰当的培养方式，使CRM197菌种得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液是本专利技术所要解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种CRM197菌种培养基，其为CRM197菌种的发酵提供充足的养分，有助于CRM197菌种的大规模扩增，获得高表达量的发酵菌液。本专利技术的第二个目的在于提供一种CRM197菌种培养基的配制方法，具有操作简单便捷、配制效率高、成本低廉的特点，且配制过程采取除菌过滤，无需高压灭菌，最大程度的保留了培养基的有效成分。本专利技术的第三个目的在于提供一种CRM197菌种发酵培养方法，其采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种CRM197菌种培养基，为液体培养基，且每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。通过采用上述技术方案，本申请的培养基中，基础营养液为CRM197菌种的主要营养来源，为其生长提供充足的营养成分；乙酸和一水麦芽糖作为碳源，为CRM197菌种提供细胞的碳架以及细胞生命活动所需的能量。乳酸钠可作为pH调节剂而使得培养基的pH较为稳定，虽然乳酸钠具有一定的抗微生物作用，但对CRM197菌种较为友好，因此其能保证CRM197菌种正常生长的同时，对其他微生物加以抑制，减少其他微生物发生营养掠夺的可能性，再培养基不使用时还能有效减少杂菌的感染。酪氨酸是构成蛋白质的氨基酸，具有电离的芳香环侧链，呈嗜水性，酪氨酸在人及动物体内由苯丙氨酸羟化而产生，既是生糖又是生酮氨基酸，其自身被吸收利用的同时还能够促进CRM197菌种对乙酸以及一水麦芽糖的吸收利用。磷酸二氢钾和磷酸氢二钾两者复合使用，作为磷钾调节剂，为CRM197菌种提供充足的磷钾元素。生长因子是一类调节微生物正常生长代谢所需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的有机物，其通过与特异性、高亲和性的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能。本申请中的生长因子a、生长因子b和生长因子c相互协调作用，进而为CRM197菌种提供良好的生长环境，有助于其大量扩增。氯化钙能够改变CRM197菌种细胞壁的通透性，其与上述其他培养基组分形成一个优良的生长环境体系，便于CRM197蛋白能顺利从细胞中分泌至细胞外，有效提高了CRM197蛋白的产量。综上，本申请的CRM197菌种培养基能够为CRM197菌种的发酵提供充足的养分，有助于CRM197菌种的大规模扩增，获得高表达量的发酵菌液。另外，本申请上述培养基的组分除酵母提取物外均可采用国产试剂，从而可以有效降低该培养基的生产成本，便于被推广使用。进一步地，每升所述基础营养液中包括有：2g精氨酸、2g天冬酰胺、0.5g门冬氨酸、0.5g谷氨酸、2gL-谷氨酰胺、0.5g甘氨酸、1.5g组氨酸、2gL-异亮氨酸、2g亮氨酸、2g赖氨酸盐酸盐、0.6g甲硫氨酸、1g苯丙氨酸、2g脯氨酸、2g丝氨酸、1g苏氨酸、0.6g色氨酸、1.5g缬氨酸和0.5gβ-丙氨酸。通过采用上述技术方案，上述组分均为CRM197菌种生长所需的氨基酸，其按上述配方加以配制，为CRM197菌种提供了一个优异的生长环境，进而促进CEM197菌种的快速扩增。进一步地，每升所述生长因子a中包括有：2gL-胱氨酸和2mL盐酸。通过采用上述技术方案，L-胱氨酸可以作为营养强化剂，有利于CRM197菌种的成长，使得CRM197菌种具有优异的生命活性；盐酸则能够促使L-胱氨酸的溶解，便于L-胱氨酸较好分散于培养基中，同时为L-胱氨酸提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRM197菌种培养基，其特征在于，为液体培养基，且每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。/n

【技术特征摘要】
1.一种CRM197菌种培养基，其特征在于，为液体培养基，且每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。


2.根据权利要求1所述的一种CRM197菌种培养基，其特征在于，每升所述基础营养液中包括有：2g精氨酸、2g天冬酰胺、0.5g门冬氨酸、0.5g谷氨酸、2gL-谷氨酰胺、0.5g甘氨酸、1.5g组氨酸、2gL-异亮氨酸、2g亮氨酸、2g赖氨酸盐酸盐、0.6g甲硫氨酸、1g苯丙氨酸、2g脯氨酸、2g丝氨酸、1g苏氨酸、0.6g色氨酸、1.5g缬氨酸和0.5gβ-丙氨酸。


3.根据权利要求1所述的一种CRM197菌种培养基，其特征在于，每升所述生长因子a中包括有：2gL-胱氨酸和2mL盐酸。


4.根据权利要求1所述的一种CRM197菌种培养基，其特征在于，每升所述生长因子b中包括有：6.5g烟酸、0.5g无水硫酸铜、0.15g庚二酸、30mL盐酸、200g七水硫酸镁、0.8g七水硫酸锌和0.393g四水氯化锰。


5.根据权利要求1所述的一种CRM197菌种培养基，其特征在于，每升所述生长因子c中包括有：0.1g维生素B1、0.75g维生素B5和0.075g维生素B6。


6.根据权利要求1所述的一种CRM197菌种培养基，其特征在于，所述CRM197菌种培养基、基础营养液、生长因子a、生长因子b和生长因子c均使用50℃-60℃的注射用水加以配制。


7.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种CRM197菌种培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、将酪氨酸用浓度为20wt％的氢氧化钠溶解，比例为10％(W/V)，得到酪氨酸溶液；
②、在容器中加入适量50℃-60℃的注射用水，按设定配...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟，郭阳漾，王丹雅，
申请(专利权)人：艾美卫信生物药业浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33