一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法技术

本发明专利技术涉及分析检测技术领域，特别涉及一种定量检测人类血浆中DPP‑4酶活性的方法，主要包括温度平衡、加质控样品和待测样品并封板孵育、加标准样品并封板孵育、加甘氨酸‑脯氨酸‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素氢溴酸盐并封板孵育、两次读板的操作步骤，具有检测周期短、操作便捷、检测准确灵敏的特点。

A method for quantitative detection of DPP-4 enzyme activity in human plasma

The invention relates to the technical field of analysis and detection, in particular to a method for quantitative detection of DPP \u2011 4 enzyme activity in human plasma, which mainly includes the operating steps of temperature balance, adding quality control samples and samples to be tested to be incubated in parallel, adding standard samples to be incubated in parallel, adding glycine \u2011 proline \u2011 7 \u2011 amino \u2011 4 \u2011 methylcoumarin hydrobromate to be incubated in parallel, and two reading boards, and has The detection cycle is short, the operation is convenient, and the detection is accurate and sensitive.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法
本专利技术涉及分析检测
，特别涉及一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法。
技术介绍
根据2010年中国慢性病及其危险因素监测报告显示，我国18岁及以上成人的糖尿病患病率达11.6％，2013年为10.7％，由此推测我国成年糖尿病患者人数为1.14亿，已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。我国糖尿病患病率从低于1％迅速增长至超过10％仅用了30年，且在一段时间内仍将呈现增加趋势。随着我国人民生活水平的提高、城镇化程度的提高以及人口老龄化加剧，糖尿病的患病率还会进一步增加。由此而带来的糖尿病本身及其并发症的高致残致死率等危害，不仅会给人们带来严重的健康问题，而且会增加相应的医疗费用，加重医疗卫生与社会经济的负担，将会成为我国公共卫生事业最为严峻的挑战。根据国际糖尿病联盟1997年分型方案，糖尿病可以分为：I型糖尿病、II型糖尿病、以及其他特异型糖尿病。其中II型糖尿病(以下简称T2D)是由于对胰岛素的抵抗作用造成的。当机体摄入食物导致血液中葡萄糖含量升高时，人体会分泌胰高血糖素样肽-1(GLP-1，以下简称GLP-1)等激素。这些激素和相对应的受体结合，合成并分泌胰岛素，抑制胰高血糖素的释放，减少肝脏葡萄糖的合成，从而降低血糖浓度。二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4酶，以下简称DPP-4酶)是一种多功能蛋白，与T细胞活化抗原CD26和腺苷脱氨酶结合蛋白同型，以可溶性形式表达于血浆和上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞等多种细胞表面。DPP-4酶的催化来自在第2位具有脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽的N端的N端二肽的水解。在T2D中，GLP-1一经分泌释放后，便迅速被血液中和广泛表达于内皮和上皮细胞表面的DPP-4酶分解。由此，DPP-4酶对合成胰岛素起着至关重要的作用，DPP-4酶的活性作为目前糖尿病的主要特征参数之一。现阶段对DPP-4酶活性的检测主要依赖于检测试剂盒，目前市面上已经有出售相应的DPP-4酶活性的检测试剂盒，并已经显示出日益增加的用于临床诊断、特别是糖尿病药物开发的希望。然而，目前在使用试剂盒检测二肽基肽酶Ⅳ活性时，其实际的检测步骤较为繁琐，且检测时间过程冗长、读板时间点多，且检测精度不足的难题。因此，急需研究出一种操作简便、检测周期短、灵敏度高的方法以实现DPP-4酶活性的测定。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，具有操作简便、检测周期短、灵敏度高的特点。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，包括以下步骤：①、开始实验前将各试剂和待测样品放在室温平衡；②、加50μL/孔的质控样品和待测样品到检测孔板中，每个待测样品4个孔；③、每个待测样品的2个孔作为对照孔，加入10μL/孔的抑制剂工作液；另外两个孔作为测试孔，加入10μL/孔1×PBS缓冲液，用封板膜封板，37℃孵育10±2min；④、加配制好的7-氨基-4-甲基香豆素的标准样品100μL/孔到空白检测孔板中，复孔2个操作；⑤、加40μL/孔的甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐到质控样品和待测样品孔中；⑥、用封板膜封板，37℃孵育10±1min后用酶标仪在Ex/Em＝355/460nm读板；⑦、读板后用封板膜封板，37℃孵育30±2min后在Ex/Em＝355/460nm再次读板；待测样品和质控样品的DPP-4酶活性的计算方式如下：酶活性(μU/mL)＝B/((T2-T1)×V)×样品稀释倍数其中，T2-T1为第二次读板前37℃下的孵育时间，单位为min；V为加入检测孔板中的样品体积，单位为mL；B为第二次和第一次读板间产生的7-氨基-4-甲基香豆素的物质的量，单位为pmol，其计算方法为使用ΔRFU作为信号值经7-氨基-4-甲基香豆素标准曲线回算出的浓度乘以每孔的体积，其浓度单位为nM，体积单位为mL；ΔRFU＝(RT2-RB2)-(RT1-RB1)其中，RT2和RB2分别为第二次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值；RT1和RB1分别为第一次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值。进一步地，所述质控样品为人类K2EDTA血浆，或为人类K2EDTA血浆与1×PBS缓冲液按体积比配制的混合物。进一步地，所述质控样品包括定量上限质控样品、高浓度质控样品、中间浓度质控样品、低浓度质控样品和定量下限质控样品；所述质控样品包括定量上限质控样品、高浓度质控样品、中间浓度质控样品、低浓度质控样品和定量下限质控样品；其中，定量上限质控样品为人类K2EDTA血浆，活性水平为170.66μU/mL；高浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为129.12μU/mL；中间浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为66.28μU/mL；低浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为44.35μU/mL；定量下限质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为21.23μU/mL。进一步地，所述标准样品为1×PBS缓冲液，或为1×PBS缓冲液与7-氨基-4-甲基香豆素中间溶液按体积比配制的混合物。进一步地，所述7-氨基-4-甲基香豆素中间溶液由175.18μL浓度为1mg/mL的7-氨基-4-甲基香豆素标准溶液与824.82μL的1×PBS缓冲液混合配制而成。进一步地，所述7-氨基-4-甲基香豆素标准溶液由0.01g7-氨基-4-甲基香豆素粉末加入10mL二甲基亚砜(DMSO)溶解配制而成。通过采用上述技术方案，本申请使用甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐(Gly-Pro-7-Amino-4-methylcoumarinhydrobromide)作为DPP-4酶的作用底物，利用样品中DPP-4酶将其分解后释放出荧光物质7-氨基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)这一原理加以测定。其中，检测过程中抑制剂工作液的加入能够抑制待测样品中DPP-4酶的活性，得到背景值后便可得出由DPP-4酶作用而产生的信号值。这个信号值在一定时间内的增加与待测样品中DPP-4酶活性成正比，因此本申请使用1×PBS缓冲液配制出一条7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线，再通过四参数拟合(权重因子为1/Y2)，以此评估待测样品中的DPP-4酶活性。与此同时，1×PBS缓冲液能够较好维持体系中DPP-4酶的活性，本申请以1×PBS缓冲液作为空白对照、使用人类K2EDTA血浆配制的质控样品，将其一起加以分析，作为参照。另外，1×PBS缓冲液作为空白对照可以评估背景信号值是否存在异常，质控样品则按照一定的接受标准用于确保实验进程本身没有问题，保证检测的准确性。从上样至得到结果，本申请的检测总时长控制在1h以内，经过两次读板，能检测到的DPP-4酶活性可以低至1.1μU/L，另外，本申请检测方法的定向范围可以达到21.23～170.66μU/mL，当待测样品出现浓度高于检测定量上限时，可以最大经过8倍稀释，并保证稀释后处于检测范围内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测人类血浆中DPP‑4酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：①、开始实验前将各试剂和待测样品放在室温平衡；②、加50μL/孔的质控样品和待测样品到检测孔板中，每个待测样品4个孔；③、每个待测样品的2个孔作为对照孔，加入10μL/孔的抑制剂工作液；另外两个孔作为测试孔，加入10μL/孔1×PBS缓冲液，用封板膜封板，37℃孵育10±2min；④、加配制好的7‑氨基‑4‑甲基香豆素的标准样品100μL/孔到空白检测孔板中，复孔2个操作；⑤、加40μL/孔的甘氨酸‑脯氨酸‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素氢溴酸盐到质控样品和待测样品孔中；⑥、用封板膜封板，37℃孵育10±1min后用酶标仪在Ex/Em＝355/460nm读板；⑦、读板后用封板膜封板，37℃孵育30±2min后在Ex/Em＝355/460nm再次读板；待测样品和质控样品的DPP‑4酶活性的计算方式如下：酶活性(μU/mL)＝B/((T2‑T1)×V)×样品稀释倍数其中，T2‑T1为第二次读板前37℃下的孵育时间，单位为min；V为加入检测孔板中的样品体积，单位为mL；B为第二次和第一次读板间产生的7‑氨基‑4‑甲基香豆素的物质的量，单位为pmol，其计算方法为使用ΔRFU作为信号值经7‑氨基‑4‑甲基香豆素标准曲线回算出的浓度乘以每孔的体积，其浓度单位为nM，体积单位为mL；ΔRFU＝(RT2‑RB2)‑(RT1‑RB1)其中，RT2和RB2分别为第二次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值；RT1和RB1分别为第一次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：①、开始实验前将各试剂和待测样品放在室温平衡；②、加50μL/孔的质控样品和待测样品到检测孔板中，每个待测样品4个孔；③、每个待测样品的2个孔作为对照孔，加入10μL/孔的抑制剂工作液；另外两个孔作为测试孔，加入10μL/孔1×PBS缓冲液，用封板膜封板，37℃孵育10±2min；④、加配制好的7-氨基-4-甲基香豆素的标准样品100μL/孔到空白检测孔板中，复孔2个操作；⑤、加40μL/孔的甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐到质控样品和待测样品孔中；⑥、用封板膜封板，37℃孵育10±1min后用酶标仪在Ex/Em＝355/460nm读板；⑦、读板后用封板膜封板，37℃孵育30±2min后在Ex/Em＝355/460nm再次读板；待测样品和质控样品的DPP-4酶活性的计算方式如下：酶活性(μU/mL)＝B/((T2-T1)×V)×样品稀释倍数其中，T2-T1为第二次读板前37℃下的孵育时间，单位为min；V为加入检测孔板中的样品体积，单位为mL；B为第二次和第一次读板间产生的7-氨基-4-甲基香豆素的物质的量，单位为pmol，其计算方法为使用ΔRFU作为信号值经7-氨基-4-甲基香豆素标准曲线回算出的浓度乘以每孔的体积，其浓度单位为nM，体积单位为mL；ΔRFU＝(RT2-RB2)-(RT1-RB1)其中，RT2和RB2分别为第二次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值；RT1和RB1分别为第一次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值。2.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述质控样品为人类K2EDTA血浆，或为人类K2EDTA血浆与1×PBS缓冲液按体积比配制的混合物。3.根据权利要求2所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡国清，祝永琴，熊垚，汤丽英，
申请(专利权)人：宁波熙宁检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33