基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法，属于生物医学技术领域。本发明专利技术将蛋白‑核酸识别技术、信号放大技术和逻辑门相结合，用CEA和CA125的适配体进行靶标识别，通过G‑四链体‑血红素复合物进行信号转变和放大，建立了针对肿瘤标志物同时检测的方法。本发明专利技术构建了一种灵敏度高、特异性强的光学生物传感器，实现了对CEA和CA125的联合检测，并基于逻辑门给出卵巢癌筛查结果；将光学检测跟信号放大技术联合起来，提高检测灵敏度；检测原理的通用性使该方法还适合基于不同的蛋白识别元件实现对不同目标物的检测。

A method of ovarian cancer screening based on ovarian cancer markers and logic gate operation

The invention discloses a method for screening ovarian cancer based on ovarian cancer markers and logic gate operation, which belongs to the field of biomedical technology. The invention combines protein \u2011 nucleic acid recognition technology, signal amplification technology and logic gate, uses the ligands of CEA and CA125 for target recognition, and uses the G \u2011 quadruplex \u2011 heme complex for signal transformation and amplification to establish a method for simultaneous detection of tumor markers. The invention constructs an optical biosensor with high sensitivity and strong specificity, realizes the joint detection of CEA and CA125, and provides the ovarian cancer screening results based on logic gate; combines optical detection with signal amplification technology to improve the detection sensitivity; the universality of detection principle makes the method also suitable for realizing the detection of different objects based on different protein recognition elements Testing.

【技术实现步骤摘要】
基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法
本专利技术涉及一种基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法，属于生物医学

技术介绍
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率占第三位，是妇科死亡率最高的肿瘤，因此早发现、早诊断、早治疗对于卵巢癌病人的康复极为重要。当早期肿瘤仅局限于卵巢时，超声检查难诊断，而血清肿瘤标志物的升高可先于影像学改变和临床症状数个月，对早期诊断具有一定临床意义。卵巢癌有多种肿瘤标志物，其中只有糖类抗原125(CA125)被临床认可并广泛应用于卵巢肿瘤中，临床上设定血清CA125的临界值为35U·mL-1，但是CA125在卵巢癌诊断中表现的特异性比较低，容易出现假阳性。为了提高了卵巢癌诊断的准确率，人们通常会将CA125和其他几种肿瘤标志物进行联合检测。癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen,CEA)是一种糖蛋白，它不是特异性肿瘤标志物，除了两种癌症大肠癌和消化道恶性肿瘤之外，在宫颈癌，卵巢上皮及非上皮性癌中都有不同程度的表达。健康成年人血清中CEA值小于2.5ng·mL-1，所以血清含量正常值一般就规定为小于5ng·mL-1。因此将CA125和CEA两种肿瘤标志物进行联合检测，可明显提高卵巢癌诊断的敏感性和准确度，有助于卵巢癌患者进行更有效的早期诊断和治疗，有助于降低因早期未及时发现卵巢癌而致使患者最终死亡事件的发生率。目前人们通常使用诸如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫分析技术等技术手段来检测患者血清中的肿瘤标志物含量，这些技术方法原理都是基于抗原抗体的结合，检测方法比较有局限性主要是因为抗体分子大而且具有免疫原性。因而，建立操作简单便携、特异性好、灵敏度高的肿瘤标志物检测方法，对癌症的理论研究和临床诊断都具有重要意义。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术将蛋白-核酸识别技术、信号放大技术和逻辑门相结合，用CEA和CA125的适配体进行靶标识别，通过G-四链体-血红素复合物进行信号转变和放大，建立了灵敏度高、准确度高的针对肿瘤标志物同时检测的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种用于卵巢癌筛查的光学生物传感器，所述的光学生物传感器为基于肿瘤标志物CEA和CA125的逻辑门，所述的逻辑门为“NOR”门和“AND”门；输入信号1为肿瘤标志物CEA，输入信号2为肿瘤标志物CA125；信号转换器为基于CEA适配体和CA125适配体的G-四链体-血红素复合物；输出信号为G-四链体-血红素复合物氧化ABTS2-的溶液吸光值；其中，所述的信号转化器通过如下方法制备：(1)将G-四链体序列分为可自组装的两段序列，分别与CEA适配体和CA125适配体相连；(2)将CEA适配体、CA125适配体和TemDNA序列混合反应，形成稳定的杂交链结构，G-四链体两段序列自组装成完整G-四链体；其中，所述的TemDNA序列为与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列；(3)再加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物，利用复合物氧化ABTS2-溶液，根据吸光值变化进行信号转化。进一步地，输入信号1的临界浓度为5ng·mL-1，超过5ng·mL-1定义为1，不超过5ng·mL-1定义为0；输入信号2的临界浓度为35U·mL-1，超过35U·mL-1定义为1，不超过35U·mL-1定义为0；四种输入信号形式分别为：CA125、CEA均未超过临界浓度，定义为(0,0)；CEA未超过临界浓度，CA125超过临界浓度，定义为(0,1)；CEA超过临界浓度，CA125未超过临界浓度，定义为(1,0)；CA125、CEA均超过临界浓度，定义为(1,1)。进一步地，所述的“NOR”门的构建方法包括如下步骤：S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体，以及TemDNA序列混合反应形成稳定的杂交链结构；S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应；S3向S2体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物，利用复合物氧化ABTS2-，测得溶液在420nm处紫外吸光值；S4吸光值超过临界值0.365时，输出为“1”，两种标志物均在正常生理浓度范围内；S5吸光值不超过临界值0.365时，输出为“0”，肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种超出正常生理浓度范围。进一步地，当输入信号为(0,0)时，输出信号为“1”，当输入信号为(0,1)、(1,0)或(1,1)时，输出信号为“0”。进一步地，所述的“NOR”门的构建方法具体包括如下步骤：S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体，以及TemDNA序列用PBS缓冲液稀释至1μmol·L-1，稀释后各取15μL混合均匀，95℃下5min，25℃下反应2h形成稳定的杂交链结构；S2向S1体系中加入2μL含有或不含有输入信号的样品，37℃孵育反应1h；S3向S2体系中加入423.5μLworkingbuffer和1.5μL10μmol·L-1的血红素溶液，于25℃下反应1h，形成G-四链体-血红素复合物，向反应体系中加入10μL0.3％的过氧化氢溶液和20μLABTS溶液反应10min，利用复合物氧化ABTS2-，测得溶液在420nm处紫外吸光值；S4吸光值超过临界值0.365时，输出为“1”，两种标志物均在正常生理浓度范围内；S5吸光值不超过临界值0.365时，输出为“0”，肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种超出正常生理浓度范围。进一步地，所述的“AND”门的构建方法，包括如下步骤：S1使用能够与适配体序列部分互补的捕获探针CEA-cDNA、CA125-cDNA将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体固定在磁珠表面，形成磁珠-适配体-cDNA复合物；S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应；S3将S2体系进行离心，取上清，灭活肿瘤标志物，释放CEA适配体和CA125适配体；S4向S3体系中加入TemDNA序列反应形成杂交链结构；S5向S4体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物，利用复合物氧化ABTS2-，测得溶液在420nm处紫外吸光值；S6吸光值超过临界值0.275时，输出为“1”，两种标志物均超过正常生理浓度范围内；S7吸光值不超过临界值0.275时，输出为“0”，肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种未超出正常生理浓度范围。进一步地，当输入信号为(1,1)时，输出信号为“1”，当输入信号为(0,1)、(1,0)或(0,0)时，输出信号为“0”。进一步地，所述的“AND”门的构建方法，具体包括如下步骤：S1用PBS缓冲液将CEA-cDNA、CA125-cDNA、CEA适配体、CA125适配体稀释到2μmol·L-1，稀释后各取75μL混匀均匀，95℃下加热5min，室温下杂交2h形成稳定的互补双链结构，加入清洗后的磁珠，混合震荡，室温下孵育1h，离心去除上清液，用100μLPBS缓冲液重悬得到磁珠-适配体-cDNA复合物；S2向S1体系中加入2μL含有或不含有输入信号的样品，37℃孵育反应1h；S3将S2体系进行离心，取上清，95℃加热30min灭活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于卵巢癌筛查的光学生物传感器，其特征在于，所述的光学生物传感器为基于肿瘤标志物CEA和CA125的逻辑门，所述的逻辑门为“NOR”门和“AND”门；输入信号1为肿瘤标志物CEA，输入信号2为肿瘤标志物CA125；信号转换器为基于CEA适配体和CA125适配体的G‑四链体‑血红素复合物；输出信号为G‑四链体‑血红素复合物氧化ABTS

【技术特征摘要】
1.一种用于卵巢癌筛查的光学生物传感器，其特征在于，所述的光学生物传感器为基于肿瘤标志物CEA和CA125的逻辑门，所述的逻辑门为“NOR”门和“AND”门；输入信号1为肿瘤标志物CEA，输入信号2为肿瘤标志物CA125；信号转换器为基于CEA适配体和CA125适配体的G-四链体-血红素复合物；输出信号为G-四链体-血红素复合物氧化ABTS2-的溶液吸光值；其中，所述的信号转化器通过如下方法制备：(1)将G-四链体序列分为可自组装的两段序列，分别与CEA适配体和CA125适配体相连；(2)将CEA适配体、CA125适配体和TemDNA序列混合反应，形成稳定的杂交链结构，G-四链体两段序列自组装成完整G-四链体；其中，所述的TemDNA序列为与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列；(3)再加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物，利用复合物氧化ABTS2-溶液，根据吸光值变化进行信号转化。2.根据权利要求1所述的光学生物传感器，其特征在于，输入信号1的临界浓度为5ng·mL-1，超过5ng·mL-1定义为1，不超过5ng·mL-1定义为0；输入信号2的临界浓度为35U·mL-1，超过35U·mL-1定义为1，不超过35U·mL-1定义为0；四种输入信号形式分别为：CA125、CEA均未超过临界浓度，定义为(0,0)；CEA未超过临界浓度，CA125超过临界浓度，定义为(0,1)；CEA超过临界浓度，CA125未超过临界浓度，定义为(1,0)；CA125、CEA均超过临界浓度，定义为(1,1)。3.根据权利要求2所述的光学生物传感器，其特征在于，所述的“NOR”门的构建方法包括如下步骤：S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体，以及TemDNA序列混合反应形成稳定的杂交链结构；S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应；S3向S2体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物，利用复合物氧化ABTS2-，测得溶液在420nm处紫外吸光值；S4吸光值超过临界值0.365时，输出为“1”，两种标志物均在正常生理浓度范围内；S5吸光值不超过临界值0.365时，输出为“0”，肿瘤标志物CEA或CA125中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，姚斌斌，荆丞，李茂林，田亚平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32