一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种稳定快速生产ε‑聚赖氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术生产ε‑聚赖氨酸的方法：是采用菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)，在含有适宜的碳源、氮源的培养基中进行发酵培养。本发明专利技术以孢子悬液直接接种，并以pH终点为转种指标，采用一步法降pH策略，进行ε‑聚赖氨酸的稳定快速发酵生产，较常规工艺产量提高了80％‑130％，周期缩短28％‑45％。本发明专利技术改变了已有生产工艺步骤，从而简化了现有发酵生产方法，显著提高了ε‑聚赖氨酸的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现产业化大规模生产。

A stable and rapid production method of \u03b5 - polylysine

The invention relates to a method for stable and rapid production of \u03b5 \u2011 polylysine, belonging to the technical field of fermentation engineering. The method for producing \u03b5 \u2011 polylysine of the invention: adopting strain amylase to produce Streptomyces diastocologenes, and carrying out fermentation culture in the medium containing suitable carbon source and nitrogen source. In the invention, the spore suspension is directly inoculated, and the pH end point is taken as the seed transfer index, and the one-step pH reduction strategy is adopted to carry out the stable and rapid fermentation production of \u03b5 \u2011 polylysine, the production is increased by 80% \u2011 130% and the cycle is shortened by 28% \u2011 45% compared with the conventional process. The invention has changed the existing production process steps, thus simplifying the existing fermentation production method, significantly improving the production intensity of \u03b5 \u2011 polylysine, not only shortening the fermentation cycle, saving the cost, but also reducing the emission of fermentation waste liquid and waste gas, reducing environmental pollution, in addition, the process is simple and easy to enlarge, and easy to realize industrial large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法
本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法。
技术介绍
ε-聚赖氨酸(亦称ε-聚-L-赖氨酸，ε-Poly-L-lysine，ε-PL)是目前从自然界中发现的两种氨基酸同聚物之一，是由微生物代谢合成(主要为放线菌，如白色链霉菌、淀粉酶产色链霉菌、北里孢菌、弗吉尼亚链霉菌、灰褐链霉菌、不吸水链霉菌，另外，球形节杆菌以及部分芽孢杆菌也可以合成)的天然产物，它由25-35个α-羧基和ε-氨基连接的L-氨基酸残基(L-Lys)组成。ε-PL是一种聚阳离子多肽，对微生物具有广谱抑菌活性，其中包括细菌如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和某些病毒。小鼠喂食实验表明，这种聚合物几乎没有急性毒性、亚慢性及慢性毒性，细菌传代实验中也未表现出致诱变性。ε-PL也能在人体内分解为赖氨酸，其是世界范围内各国允许在食品中强化的一种氨基酸，同时也是人体必需的八种氨基酸之一。此外，它还具有优良的稳定性和水溶性，其水溶液在加热处理100℃中煮沸30min甚至121℃高压蒸汽处理20min均不会产生分解。正是基于上述优良特性(抑菌谱广、安全性高、热稳定性好、生物可降解)，在一些国家(如日本、韩国、美国、比利时等)批准其作为一种食品防腐剂应用于食品工业中。2012年申请人联合天津科技大学等提交了ε-PL及其盐酸盐为食品添加剂申请材料，2014年4月，中国国家卫生计生委食品安全标准与监测评估司批准了ε-聚赖氨酸(ε-PL)及其盐酸盐(ε-PL·HCL)可作为食品添加剂新品种应用于大米及制品、小麦粉及其制品、杂粮制品、烘烤食品、肉及肉制品、调味品、果蔬汁类及其饮料、水果、蔬菜(包括块根类)、豆类、食用菌、藻类、坚果以及籽类等食品工业中。此外，其在化妆品、基因载体、药物包被、水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有重要的应用。因此，ε-PL及其盐酸盐具有非常广阔的应用潜力及商业市场前景。在国内，虽然ε-PL及其盐酸盐作为新的食品添加剂使用才短短的五年时间，相对来说整体的行业规模还比较小，属于起步阶段，但是，随着食品工业对ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的认知度越来越高，除国外市场依旧很大外，国内市场的需求量也将不断增加，另外，作为该行业的领航企业申请人于2019年启动的扩大使用范围相关工作，并于2019年4月9日在国家风险评估中心征求意见公示。目前，ε-PL的获得仍然主要依靠微生物发酵技术，1989年日本智索股份有限公司(ChissoCorporation)首先利用白色链霉菌发酵技术实现了ε-PL的工业化生产，且于2001年形成了年产千吨级的规模。而国内虽然已有少数几家企业实现了ε-PL的工业化生产，但限于相对落后的技术水平，发酵水平普遍偏低，即使有报道产量相对高的，也仅主要在小试水平实现，难以放大生产，因此，国内生产现状亟需提高，打破现有技术壁垒，研究开发新的发酵工艺，对提高ε-PL生产能力，扩大ε-PL的工业化生产规模，增大国产ε-PL的市场份额具有非常重要的意义。经过检索，截至目前，我国公布的有关ε-PL及其盐酸盐发酵生产的主要专利有：1.专利号为ZL97182253.0的“大量生产ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法”专利技术专利，是岩田敏治等人在中国申请的专利，该专利是在获得诱变菌株B21021(FERMBP-5926)基础上，于培养基中好气培养该菌株，然后从发酵液中分离和纯化ε-聚-L-赖氨酸。2.专利号为ZL200510037774.2的“利用北里孢菌PL6-3制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”专利技术专利，公开了一种通过筛选的北里孢菌(Kitasatosporasp.)PL6-3发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法。3.专利号为ZL200610013800.2的“回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法”的专利技术专利，公开了一种回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，该专利的保护点在于将提取过程后期的穿透液循环使用，进而发酵生产ε-聚-L-赖氨酸。4.专利号为ZL200710057098.4的“一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的专利技术专利，公开了一种诱变白色链霉菌菌株TUST2及利用该菌株进行ε-聚赖氨酸及其盐发酵的方法。5.专利号为ZL200810153709.X的“高抑菌活性ε-聚-L-赖氨酸组分的制备方法”的专利技术专利，是申请人与天津科技大学共同申请的。该专利将通过微生物发酵法得到的ε-PL发酵液，经过微滤、超滤和纳滤组合多级分离技术获取高抑菌活性ε-聚-L-赖氨酸。6.专利号为ZL200910025270.7的“一株球形节杆菌菌株及其在发酵生产ε-聚赖氨酸中的应用”的专利技术专利，公开了一株球形节杆菌ArthrobacterglobiformisQC18，并利用该菌株发酵产ε-聚赖氨酸。7.专利号为ZL200910030330.4的“一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺”的专利技术专利，公开了一种将吸附固定化材料固定于发酵罐中，以实现生产菌株固定于该材料上，进而实施固定化生产ε-聚赖氨酸的发酵工艺。8.申请号为200910071853.3的“一种ε-聚赖氨酸的制备方法”，公开了一种利用弗吉尼亚链霉菌发酵制备ε-聚赖氨酸的方法。9.专利号为ZL200910069517.5的“一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法”的专利技术专利，公开了一种采用淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌进行ε-聚赖氨酸发酵的方法，该方法通过流加L-赖氨酸来提高ε-聚赖氨酸产量，较不流加产量提高25-50％。10.专利号为ZL200910224087.X的“一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的专利技术专利，公开了一种灰褐链霉菌StreptomycesgriseofuscusLS-H1，并利用该菌株发酵积累ε-聚赖氨酸及其盐的方法。在优化条件下，产量可达0.7-20g/L。11.专利号为ZL201010585034.3的“一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法”，公开了一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法，该方法利用与德拉根道夫试剂复合，从而不需加入指示剂即可筛得ε-聚赖氨酸产生菌。12.申请号为201010609202.8的“一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的方法”，公开了一种通过微波、硫酸二乙酯复合诱变获得高产菌株的方法，利用该菌株摇瓶发酵水平从0.6g/L提高至0.85g/L。13.专利号为ZL201110152802.0的“不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”，公开了一种新筛选的不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。14.申请号为201110250123.7的“一种利用甘油为单一碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种采用甘油作碳源，结合两阶段pH调控策略和流加发酵方法生产ε-聚赖氨酸的方法。15.申请号为201110274326.X的“一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种采用葡萄糖和甘油共同作为碳源，发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。16.专利号为ZL201110333684.3的“一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法”的专利技术专利，公开了一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，该专利的保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定、快速生产ε‑聚赖氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：将链霉菌孢子悬液接种于种子培养基中，进行种子培养，待pH降至4.0‑6.0，得到种子液，将所述种子液接入发酵培养基中，在温度28‑32℃，溶氧20‑50％下发酵培养，当发酵液中葡萄糖浓度降至8‑10g/L时，流加补料培养基，恒定发酵液中葡萄糖浓度在10‑12g/L；待发酵液pH降至3.0‑4.5，维持恒定pH3.0‑4.5；待ε‑聚赖氨酸不再增加，结束发酵。

【技术特征摘要】
1.一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：将链霉菌孢子悬液接种于种子培养基中，进行种子培养，待pH降至4.0-6.0，得到种子液，将所述种子液接入发酵培养基中，在温度28-32℃，溶氧20-50％下发酵培养，当发酵液中葡萄糖浓度降至8-10g/L时，流加补料培养基，恒定发酵液中葡萄糖浓度在10-12g/L；待发酵液pH降至3.0-4.5，维持恒定pH3.0-4.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。2.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述种子培养中，待所述pH降至4.5-5.5，得到种子液。3.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养中，待所述发酵液pH降至3.5-4.5，维持恒定pH3.5-4.5。4.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述链霉菌孢子悬液的制备步骤为：取生长成熟的链霉菌孢子加入生理盐水中，经摇匀，棉纱过滤，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤1-3次，得到孢子悬液，所述孢子悬液所含孢子量为107-108个/ml。5.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述孢子悬液接种至种子培养基的接种量为0.2％-2％；所述种子液的培养温度为：28-32℃。6.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述种子液接入发酵培养基的接种量为5％-20％；所述发酵的溶氧为20-35％。7.如权利要求1所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述补料培养基组成为(g/L)：葡萄糖600-1000，硫酸铵30-50，pH自然，余量为水。8.如权利要求1所述一种稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭凤柱，周斌，朱勇刚，梅吉雷，汤强，张秋生，张利钢，孟根水，贾士儒，
申请(专利权)人：浙江新银象生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33