本发明专利技术属于基因工程和微生物技术领域，具体芽胞杆菌rex基因在提高聚γ‑谷氨酸产量中的应用。本方法采用分子生物学技术，通过在地衣芽胞杆菌中敲除转录抑制因子基因rex，获得了rex缺失的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02△rex，显著提高了地衣芽胞杆菌甘油代谢的速率。WX‑02△rex在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX‑02至少提高了10.55%，最高可达27.94%。利用该菌株在聚γ‑谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ‑谷氨酸的产量，至少提高了35.29%，最高可达50%。说明该基因工程改造方法在提高微生物甘油代谢速率具有重要作用，并提高甘油合成生物基化学品的效率。
Application of Bacillus Rex Gene in Increasing the Yield of Poly-gamma-glutamic Acid
【技术实现步骤摘要】
芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。
技术介绍
聚γ-谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶、多聚γ-谷氨酸，它是一种通过微生物发酵法制得的生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成，分子量通常为10KD-10000KD。γ-PGA具备良好的水溶性、吸附能力、可被生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在众多领域中具有广泛的应用价值，在医学领域中，可用作药物缓释剂；在污水处理方面，可作为吸附剂和絮凝剂；在农业领域，可作为保水剂，增肥剂，增效剂。由于γ-PGA具有良好的经济价值和广泛的应用前景，γ-PGA的生产受到愈来愈广泛的重视。NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，主要产生于糖酵解和柠檬酸循环，用于胞内大多数氧化还原反应，是微生物生命代谢活动中必不可少的辅因子；Rex，NADH相关的转录因子，对细胞内氧化还原电位作出反应，并对参与革兰氏阳性细菌能量代谢和发酵生长的基因的表达进行负性控制；Rex的DNA结合活性受细胞内NADH/NAD+比率的调节，在较低的NADH:NAD+比值下，Rex蛋白与靶位点结合，抑制参与NADH再氧化的基因转录，而NADH浓度的升高导致Rex与DNA的解离和靶基因的转录阻遏解除。目前国内外对Rex的研究主要集中在它的结构，NADH结合Rex的构型变化，Rex的DNA结合位点的保守性的研究。目前尚无芽胞杆菌中rex与聚γ-谷氨酸相关性的研究。本申请以地衣芽胞杆菌为例，发现通过在地衣芽胞杆菌中通过敲除rex能够显著提高聚γ-谷氨酸的产量，在芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸方面具有重要的科研意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，通过敲除地衣芽胞杆菌中rex基因，能够显著提高地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸的产量。本专利技术的另一个目的在于提供了一种适用于芽胞杆菌rex缺失株的培养基，利用该培养基对该菌株进行发酵培养，可显著提高聚γ-谷氨酸的产量。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，包括利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中rex或使得rex基因沉默或降低rex基因的表达量，通过发酵来提高芽胞杆菌中聚γ-谷氨酸产量。以上所述的方法中，优选的，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌，优选菌株为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，CCTCCNO:M208065。以上所述的应用中，当使用敲除的方式时，优选下述步骤：(1)采用PCR的方法扩增出地衣芽胞杆菌WX-02的rex基因上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到rex的敲除载体T2(2)-rex。(2)将T2(2)-rex电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到rex基因的上游同源臂或rex基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；(3)将步骤(2)菌株接种于培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到rex基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02△rex。所述的rex基因上下同源臂序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述rex基因编码的蛋白质为SEQIDNO.3所示。一种适用于芽胞杆菌rex缺失株的培养基，所述培养基配方，包括：60-100g/L甘油，8-16g/L柠檬酸钠，20-40g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.3-0.7g/L，氯化钙0.3-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.7g/L，氯化铁0.003-0.005g/L，硫酸锰0.3-0.7g/L。以上所述的培养基，优选的，所述的培养基配方：80g/L甘油，12g/L柠檬酸钠，20g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铁0.004g/L，硫酸锰0.5g/L。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：转录因子Rex是芽胞杆菌中一种重要的维持NADH和NAD+平衡的转录因子，本研究通过缺失rex，显著提高了地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸产量。该研究结果表明缺失转录因子基因rex是一种十分有效的提高微生物合成聚γ-谷氨酸能力的方法，利用本专利技术提供的方法获得的地衣芽胞杆菌WX-02△rex菌株，利用该菌株在不同的聚γ-谷氨酸发酵培养基中能够显著提高甘油利用速率和聚γ-谷氨酸的产量，聚γ-谷氨酸至少提高了10.7％，最高可达50％。本研究为微生物利用甘油高产聚γ-谷氨酸提供了一种新策略。附图说明图1为Rex敲除载体和Rex敲除菌株构建流程示意图。图2为实施例1中PCR扩增基因Rex上下游同源臂和上下游同源臂SOE连接片段；其中泳道M为5KDNAmarker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为基因Rex上游同源臂；泳道2为基因Rex下游同源臂；泳道3为基因Rex上下游同源臂SOE连接片段。图3为实施例1中T2(2)-rex质粒构建PCR验证胶图；其中泳道1为T2(2)-rex质粒构建大肠杆菌菌落PCR验证；泳道M为5KDNAmarker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。图4为实施例2中T2(2)-rex质粒电转化至地衣芽胞杆菌PCR验证胶图；泳道1、2：T2(2)-rex质粒电转化至地衣芽胞杆菌菌落PCR验证；泳道M：5KDNAmarker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。图5为实施例2中Rex敲除菌株的PCR验证胶图；泳道1：Rex敲除菌株的菌落PCR验证胶图；泳道M：5KDNAmarker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式结合以下实例，对本专利技术进行进一步说明，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：地衣芽胞杆菌rex敲除载体的构建步骤1：根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的rex基因(该基因编码的蛋白为SEQIDNO.3所示)的上、下游序列，设计rex基因的上游同源臂引物(A-F和A-R)、下游同源臂引物(B-F和B-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以rex基因的上游同源臂引物、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.芽胞杆菌
【技术特征摘要】
1.芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中的提高方法包括利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中rex基因或将rex基因沉默或降低rex基因的表达量。3.根据权利要求1所述的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌。4.根据权利要求1所述的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）WX-02。5.根据权利要求4所述的应用，其中所述的敲除地衣芽孢杆菌中rex基因，其步骤包括：（1）采用PCR的方法扩增出地衣芽胞杆菌WX-02的rex基因上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到rex的敲除载体T2(2)-rex；（2）将T2(2)-rex电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，占杨杨，周梦林，马昕，李鑫，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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