一种提高γ-氨基丁酸产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高γ‑氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。本发明专利技术敲除大肠杆菌基因组上ADP‑L‑甘油‑D‑甘露‑庚糖‑6‑差向异构酶RfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，GABA产量达到0.6415g/L，是野生菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍；且重组菌WJW00发酵产物中，副产物有机酸的含量均降低，如发酵24h时，丙酮酸、乙酸、乳酸的含量相对于野生菌W3110分别降低65.1％、38.9％、56.6％。本发明专利技术提供了一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种提高γ-氨基丁酸产量的方法
本专利技术涉及一种提高γ-氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。
技术介绍
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyricacid，GABA)是一种游离氨基酸，在食品、药品、动物饲料等方面有良好的应用价值和前景。GABA是人体中枢神经系统中一种抑制性神经递质，对神经元的活动及相互联系具有抑制性调控作用，可舒肝解虑、宁心安神、降血压、降低血糖等，对多种疾病有较好的疗效。在饲料中添加GABA对猪、牛、鸡等的养殖都有促进作用。在植物中，GABA与植物生长发育密切相关。为了满足多种需求，GABA的生产是必要的。微生物发酵法生产GABA和化学合成法相比，具有生产过程和产品的安全性好、环境友好的优点；和植物提取相比，具有产量高不受季节和地域限制的优点；因而利用微生物生产GABA是发酵工程领域近年来的一个研究热点。目前生产GABA主要通过微生物合成法，添加谷氨酸或谷氨酸钠发酵生产，利用此工艺生产GABA的菌株主要有乳酸菌、霉菌、酵母和大肠杆菌。其中霉菌和酵母生产GABA产量很低，多以乳酸菌和大肠杆菌尤为常见，但是乳酸菌合成GABA需要添加大量的谷氨酸和谷氨酸钠才能实现，虽然以L-Glu和谷氨酸钠前体生物合成GABA的研究已经取得了较高的产量，但以葡萄糖等糖类物质为起始底物直接生产GABA的研究，有助于GABA合成成本的进一步降低；且反应pH为4.5-5.0(采用50％硫酸调节pH)，大量使用硫酸对发酵罐的耐腐蚀性和生产操作的安全性都提出很高要求；此外，乳酸菌的分子改造工具不成熟，很难实现进一步的改造。而大肠杆菌的基因工程手段和工具成熟，分子操作成熟、背景清晰，且可以利用葡萄糖直接发酵生产GABA。基因工程改造的大肠杆菌在发酵生产多种产品中表现出优良的特性，因而以大肠杆菌出发菌株构建可直接合成GABA的研究具有可操作性和应用前景。目前改造野生大肠杆菌合成GABA，一般以其代谢改造途径出发。但是这些方法使得GABA产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，意外的发现rfaD基因的敲除可以显著改善大肠杆菌合成GABA的能力，GABA产量达到0.6415g/L，是野生对照菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍。本专利技术的第一个目的是提供一种高效合成γ-氨基丁酸(GABA)的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110或大肠杆菌DH5α。在一种实施方式中，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。在一种实施方式中，所述发酵具体是：将所述重组菌的种子液转接至发酵培养基，并加入卡那霉素和诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后进行发酵。在一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种至LB培养基中，并添加卡那霉素，37℃培养至对数中期得到。在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：15-25g/L葡萄糖，15-20g/LNa2HPO4·12H2O，1-5g/LKH2PO4，0.2-0.8g/LNaCl，添加1-3mMMgSO4，0.1-0.3mMCaCl2，0-10mg/mL维生素B1。在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成具体为：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，添加1mMMgSO4，0.1mMCaCl2，10mg/mL维生素B1。本专利技术还提供所述方法在食品、药品制备或动物饲料领域的应用。在一种实施方式中，所述药品制备是将生产得到的GABA用于制备可舒肝解虑、宁心安神、降血压或降低血糖的药物。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，GABA产量达到0.6415g/L，是野生菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍。(2)重组菌WJW00发酵产物中，副产物有机酸的含量均降低，如发酵24h时，丙酮酸、乙酸、乳酸的含量相对于野生菌W3110分别降低65.1％、38.9％、56.6％。(3)敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00，其外膜关键分子脂多糖(LPS)被改造为Kdo2-lipidA结构，重组菌WJW00中外膜关键分子的去除可以有效改善细胞特性，减少大肠杆菌某些外膜关键分子带来的安全隐患。生物材料野生型大肠杆菌W3110购买自ATCC，保藏编号为ATCC39936。附图说明图1：工程菌WJW00的构建。图2：48小时发酵后W3110和WJW00细胞胞外氨基酸和GABA水平的比较；Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Asn，天冬酰胺；Ser，丝氨酸；Gln，谷氨酰胺；His，组氨酸；Gly，甘氨酸；Thr，苏氨酸；Arg，精氨酸；Ala，丙氨酸；GABA，γ-氨基丁酸；Tyr，酪氨酸；Cys，半胱氨酸；Val，缬氨酸；Met，蛋氨酸；Trp，色氨酸；Phe，苯丙氨酸；Ile，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸。图3：发酵24小时和48小时后W3110和WJW00细胞中的乙酸，乳酸和丙酮酸水平。具体实施方式氨基酸的测定方法：(1)样品制备①对于每个时间点的样品，采取10000rpm离心20min，弃菌体，取1mL上清。②按1:1的比例加入三氯乙酸溶液，放置在4℃冰箱过夜备用。沉淀蛋白。③过夜三氯乙酸和上清混合样品在10000rpm离心20min，去除发酵液中蛋白残留，防止堵塞色谱柱。④用注射器小心吸出上清，接上水相或有机相滤膜0.22μm过滤，去除尽量多的杂质，直接取出200μL注入带有内衬管的液相小瓶，盖上盖子密封备用。(2)HPLC测定高效液相色谱系统采用安捷伦1200/岛津ProminenceLC-20A/沃特世e2696，检测器采用紫外检测器。色谱柱为碳-18柱，主要包括DiamonsilAAA柱/HypersilODS柱/Shim-packVP-ODSC18柱/AdvanceBioAAAC18柱等。安捷伦1260和1200系统是四通道系统，A相为水相、B相为有机相、C相为纯水、D相为纯甲醇。A相成分为，无水乙酸钠4.52g，三乙胺200μl/L，四氢呋喃5mL/L；B相成分为无水乙酸钠4.52g/L，甲醇400mL，乙腈400mL。ABCD相连接系统前均需超声除气，待基线平稳后再跑样，需要每次跑液相之前检查氘灯。ABCD相配制后需要使用有机膜或水相膜抽滤2次后并超声后方可使用，压力设定为0.1帕。色谱柱温度设置为40℃。具体液相进样程序和梯度洗脱程序见表1和表2。表1柱前衍生程序设置表2洗脱程序设置线性梯度的方法实施例1工程菌WJW00的构建工程菌WJW00已经在SCI论文《Constru本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效合成γ‑氨基丁酸(GABA)的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上ADP‑L‑甘油‑D‑甘露‑庚糖‑6‑差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。

【技术特征摘要】
1.一种高效合成γ-氨基丁酸(GABA)的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110或大肠杆菌DH5α。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的方法，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。5.根据权利要求4所述的方法，所述发酵具体是：将所述重组菌的种子液转接至发酵培养基，并加入卡那霉素和诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后进行发酵。6.根据权利要求5所述的方法，所述种子液是将所述重组菌接种至LB培养基中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，王建莉，马文渐，方宇，李烨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32