一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：以大豆或豆粕为原料制备大豆浆液；大豆浆液经蛋白酶适度酶解使大豆蛋白的水解度控制在10～35％；将大豆蛋白酶解物中固形物质量百分浓度调整为1～6％，添加葡萄糖或蔗糖，谷氨酸钠，用作培养枯草芽孢杆菌的培养基；将枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于大豆蛋白酶解物培养基，摇床培养或发酵罐通气培养36～54h后终止发酵，收获γ‑聚谷氨酸。本发明专利技术提供的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法能显著提高γ‑聚谷氨酸产量，且原料价廉易得，能有效降低成本，因而具有良好的应用前景。

A Method for Production of Gamma-Polyglutamic Acid by Fermentation of Soybean Protease Hydrolysate

【技术实现步骤摘要】
一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
本专利技术属于微生物工程
，尤其涉及一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸(简称γ-PGA)，一种由微生物合成的高分子氨基酸聚合物，分子质量一般都在5万到200万道尔顿之间。γ-聚谷氨酸作为一种新型天然高分子材料，配合其无毒无害的特性，被广泛应用于化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等多个领域。γ-聚谷氨酸的工业生产方法一般采用微生物发酵合成法。在过去的几十年中，产业界和学术界对γ-聚谷氨酸的生产工艺进行了大量探索，虽然取得了重大进展，但γ-聚谷氨酸产品的价格依然昂贵，这在很大程度上限制了γ-聚谷氨酸的广泛应用。究其原因，是γ-聚谷氨酸生产效率低、生产成本高所致。因此，改进发酵工艺是提高γ-聚谷氨酸生产水平的重要途径。对于发酵工艺而言，优化培养基是获得高产的必要环节。优良的菌种必须与其相适应的培养基及培养条件结合，才能充分发挥其生产潜力。如中国专利申请第02151746号公开了枯草芽孢杆菌NX-2及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第200410010509号公开了枯草芽孢杆菌zju-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请200610155278号公开了利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和制备γ-聚谷氨酸的方法。上述现有技术都涉及将培养基优化使之适于生产菌的生长及促进γ-聚谷氨酸的合成。在枯草芽孢杆菌发酵合成γ-聚谷氨酸的代谢过程中，培养基中必须有充足的可利用碳源和氮源，有些谷氨酸依赖型菌株还需要提供充足的谷氨酸或谷氨酸钠作为前体来合成γ-聚谷氨酸。文献报道常用的使γ-聚谷氨酸增产的氮源物质有各种蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等生化试剂，这些昂贵的生化试剂是γ-聚谷氨酸生产成本高昂的重要原因之一。另外，这些生化试剂作为氮源对我们试验的枯草芽孢杆菌而言，其γ-聚谷氨酸的增产效果并不明显。因此，开发新型的价格低廉、增产效果显著的氮源对提高γ-聚谷氨酸的生产水平和降低生产成本具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对现有γ-聚谷氨酸生产技术中原料成本高、生产效率低的不足，以廉价易得的大豆或豆粕为原料制浆，经适度酶解后将大豆蛋白酶解物用作培养枯草芽孢杆菌的氮源物质来发酵生产γ-聚谷氨酸，达到提高γ-聚谷氨酸的产量，降低生产成本的目的。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：步骤一：清洗大豆或豆粕，加入8～15倍质量的去离子水，在20～30℃浸泡4～10h，用豆浆机打浆过滤去渣，得大豆浆液；步骤二：调节步骤一得到的大豆浆液至pH值为8～11，加入碱性蛋白酶20～200万u/L，40～65℃保温酶解1～8h，控制蛋白质水解度为10～35％，然后加热灭酶活，冷却，5000r/min离心分离20min，取上清液，得大豆蛋白酶解物；其中，碱性蛋白酶活力单位定义为：在40℃，pH10的测定条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸所需要的酶量即为一个酶活力单位，用u表示。步骤三：调节步骤二得到的大豆蛋白酶解物浓度，加入碳源及聚谷氨酸合成前体物质，调节pH6～8，于110～121℃灭菌20～30min后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基；其中，大豆蛋白酶解物培养基的组成为：大豆蛋白酶解物中固形物质量百分浓度为1～6％，添加碳源(葡萄糖或蔗糖)10～30g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)20～50g/L。步骤四：取活化的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种接种到种子液培养基，种子液培养基在250mL锥形瓶的装液量为50～70mL，37℃摇床培养或通气培养16～24h，得枯草芽孢杆菌种子液。其中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为枯草芽孢杆菌DG02(分类命名：Bacillussubtilis；保藏日期：2019年4月9日；保藏编号：GDMCCNo：60626；保藏单位全称：广东省微生物菌种保藏中心；保藏单位简称：GDMCC；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)。枯草芽孢杆菌种子液培养基的组成为：豆芽汁1000mL，蔗糖50g，自然pH，121℃灭菌20min。豆芽汁的制备方法为：500g黄豆芽加入1000mL水，煮沸浓缩至500mL后，过滤去渣即为豆芽汁。步骤五：将步骤四得到的枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于步骤三得到的大豆蛋白酶解物培养基，然后在33～39℃摇床培养或发酵罐通气培养36～54h后，终止发酵，得发酵液。步骤六：将步骤五所得的发酵液经离心去除菌体，用高效液相色谱或CTAB沉淀法测定发酵液中γ-聚谷氨酸的含量。本专利技术的有益效果在于：大豆及豆粕来源广、蛋白质含量高、价格低，本专利技术以大豆或豆粕为原料制浆后用蛋白酶将豆浆中的蛋白质进行水解获得大豆蛋白酶解物，较其它蛋白酶解物具有原料价廉易得、品质稳定的优势；豆浆中除蛋白质外还含有丰富的可溶性糖类、矿物质、磷脂、维生素等营养成分，较大豆分离蛋白更适于微生物生长；所用碱性蛋白酶较中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶等其他蛋白酶更适于水解大豆蛋白，具有水解速率高、酶用量少的优势；以大豆蛋白酶解物作为培养基氮源较采用其它蛋白胨、酵母膏(酵母粉)、牛肉膏等生化试剂作氮源显著节省原料成本；由于大豆活性肽具有促进多种微生物生长及发酵产物合成的生物活性，通过控制大豆蛋白酶解物的水解度及优化培养基组成、培养条件可使γ-聚谷氨酸产量比采用生化试剂培养基发酵提高一倍以上。保藏证明分类命名：Bacillussubtilis拉丁文学名：BacillussubtilisDG02保藏日期：2019年4月9日保藏编号：GDMCCNo：60626保藏单位全称：广东省微生物菌种保藏中心保藏单位简称：GDMCC保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式并不限于此。实施例1(1)种子液培养基的制备在500g大豆芽中加水1000mL，煮沸浓缩至500mL时，过滤弃渣得豆芽汁；取豆芽汁200mL，蔗糖10g，自然pH，121℃灭菌20min，冷却后即为枯草芽孢杆菌种子液培养基。(2)大豆蛋白酶解物培养基的制备步骤一：大豆清洗后加入10倍质量的去离子水25℃浸泡8h，用豆浆机打浆过滤去渣得大豆浆液，固形物浓度约为6％。步骤二：在500mL锥形瓶中加入大豆浆液200mL，调节pH至10，加入碱性蛋白酶160万u/L，60℃、120r/min水浴振荡酶解2h，100℃加热10min灭酶活，冷却后5000r/min离心20min，过滤去除沉淀物及漂浮的脂肪，所得浅黄色清液即为大豆蛋白酶解物，测得其水解度为18.34％。步骤三：将大豆蛋白酶解物稀释至固形物质量百分浓度为3％，添加碳源葡萄糖20g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)50g/L，调pH7.0；250mL锥形瓶中培养基装液量60mL；在110℃，20min灭菌后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基。(3)γ-聚谷氨酸的发酵合成取活化的枯草芽孢杆菌DG02斜面菌种接种到种子液培养基，于37℃、150r/min恒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：清洗大豆或豆粕，加入8～15倍质量的去离子水，在20～30℃浸泡4～10h，用豆浆机打浆过滤去渣，得大豆浆液；步骤二：调节步骤一得到的大豆浆液至pH值为8～11，加入碱性蛋白酶20～200万u/L，40～65℃保温酶解1～8h，控制蛋白质水解度为10～35％，然后加热灭酶活，冷却，5000r/min离心分离20min，取上清液，得大豆蛋白酶解物；步骤三：调节步骤二得到的大豆蛋白酶解物浓度，加入碳源及聚谷氨酸合成前体物质，调节pH6～8，于110～121℃灭菌20～30min后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基；步骤四：取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种到种子液培养基，37℃摇床培养或通气培养16～24h，得枯草芽孢杆菌种子液；步骤五：将步骤四得到的枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于步骤三得到的大豆蛋白酶解物培养基，33～39℃恒温摇床培养或通气培养36～54h后，终止发酵，得发酵液；步骤六：将步骤五得到的发酵液离心分离、去菌体，测定发酵液中γ‑聚谷氨酸含量。

【技术特征摘要】
1.一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：清洗大豆或豆粕，加入8～15倍质量的去离子水，在20～30℃浸泡4～10h，用豆浆机打浆过滤去渣，得大豆浆液；步骤二：调节步骤一得到的大豆浆液至pH值为8～11，加入碱性蛋白酶20～200万u/L，40～65℃保温酶解1～8h，控制蛋白质水解度为10～35％，然后加热灭酶活，冷却，5000r/min离心分离20min，取上清液，得大豆蛋白酶解物；步骤三：调节步骤二得到的大豆蛋白酶解物浓度，加入碳源及聚谷氨酸合成前体物质，调节pH6～8，于110～121℃灭菌20～30min后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基；步骤四：取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种到种子液培养基，37℃摇床培养或通气培养16～24h，得枯草芽孢杆菌种子液；步骤五：将步骤四得到的枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于步骤三得到的大豆蛋白酶解物培养基，33～39℃恒温摇床培养或通气培养36～54h后，终止发酵，得发酵液；步骤六：将步骤五得到的发酵液离心分离、去菌体，测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量。...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹水洋，张乐，叶植湘，陈旭，张书艳，苏沛，
申请(专利权)人：东莞理工学院，中储粮油脂工业东莞有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44