本发明专利技术公开了一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用，所述毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示的溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。本发明专利技术采用两种质粒介导的重组菌构建方法，得到拷贝数为13的重组菌；重组菌产溶菌酶酶活高，120‑140h内发酵酶活45‑50KU/mL。
A recombinant Pichia pastoris engineering strain containing lysozyme gene with high copy number of egg white and its application
【技术实现步骤摘要】
一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用(一)
本专利技术构建了一种含有高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母及其生产溶菌酶的应用。(二)技术背景溶菌酶是一种特异性作用于细胞壁的有效抗菌剂，破坏细胞壁的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4-糖苷键，分解不溶性黏多糖为可溶性糖肽，具有溶菌作用。溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布：溶菌酶应用于食品工业中是安全的，我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收。因此不会在体内残留，无毒性，安全性很高，在药品、饲料和食品等行业具有广泛的应用前景。在食品工业中可应用于水产品、乳制品、果蔬、肉类、酒及饮料的防腐保鲜。在畜牧业溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在医学上溶菌酶可以代替抗生素作为抗菌消炎的药物。溶菌酶是一种碱性球蛋白，等电点为10.7-11.3，相对分子量为14.3kDa，最适pH6-7，最适温度50℃，分子中有4个二硫键。目前，溶菌酶主要从鸡蛋清和蛋壳膜中提取。但这种直接提取的生产方式，其规模小、成本高，不利于大规模化生产与应用。特别是，随着饲料用的抗生素的管理不断加强，溶菌酶的市场需求正快速扩大。利用基因工程技术构建溶菌酶大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。目前在溶菌酶工程菌构建方面申请的专利较多，包括蛋清溶菌酶(CN101050467B、CN104263709A、CN104694559A、CN105039189B、CN104946675A)、人源溶菌酶(CN1325958、CN1300852A、CN1289678C、CN1664096A、CN102229939B、CN104278017A、CN109295033A、CN109295088A)、猪源溶菌酶(CN107236681A、CN105861468A、CN106046173A)等。为了提高溶菌酶的表达能力，本专利技术将通过两种整合型质粒，携带人工组装的多拷贝溶菌酶基因表达读码框，整合到毕赤酵母基因组，挑选多拷贝整合工程菌株，构建蛋清溶菌酶的高拷贝数整合的毕赤酵母工程菌。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的毕赤酵母工程菌，实现发酵法高效生产蛋清溶菌酶。本专利技术采用的技术方案是：第一方面，本专利技术提供一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌是将SEQIDNO.1所示的来源于Gallusgallus蛋清的经过密码子优化的溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。所述毕赤酵母优选毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，所述的毕赤酵母工程菌记为重组毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)IEF-ewlyz13。所述蛋清溶菌酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2，NCBI数据库登入号GenBankProteinID：AAL69327。进一步，所述高拷贝数是指蛋清溶菌酶基因的拷贝数为13。本专利技术所述重组毕赤酵母工程菌(优选IEF-ewlyz13)的构建方法，包括以下步骤：1)通过基因合成公司合成密码子优化的蛋清溶菌酶基因，其核苷酸序列SEQIDNO.1，并将其克隆到分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-EWlyz，图1所示；2)将pPIC9K-EWlyz采用限制性内切酶SacI线性化后，转化毕赤酵母GS115菌株中，通过高浓度G418抗性平板筛选、透明圈平板高通量筛选和三角瓶发酵实验，筛选得到高拷贝子和高活性的重组菌株EWC91，经定量PCR分析表明蛋清溶菌酶基因的拷贝数为5；所述高浓度G418抗性平板是指3.5g/L遗传霉素G418的YPD平板；3)将pPIC9K-EWlyz上的蛋清溶菌酶基因表达阅读框克隆到pPICZαA质粒上，并构建含有4个拷贝数的重组表达质粒pPICZαA-EWlyz4，如图2所示；4)将pPICZαA-EWlyz4采用限制性内切酶SalI线性化后，转化上述筛选得到的重组菌株EWC91，通过Zeocin抗性平板筛选、透明圈平板高通量筛选和三角瓶发酵实验，筛选得到高拷贝子和高活性的重组菌株IEF-ewlyz13，经定量PCR分析表明蛋清溶菌酶基因的拷贝数为13，该菌株记为重组毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)IEF-ewlyz13。第二方面，本专利技术提供一种所述重组毕赤酵母工程菌(优选菌株PichiapastorisIEF-ewlyz13)发酵制备溶菌酶的应用。本专利技术所述发酵方法如下：(1)将甘油管中保藏的重组毕赤酵母工程菌(优选PichiapastorisIEF-ewlyz13)菌液，划线到YPD平板上，25-30℃(优选30℃)培养40h；将单菌落接种到种子培养基中，25-30℃，100-250rpm(优选30℃、200rpm、20h)培养至对数生长中期，获得种子液；所述YPD平板组成如下：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH自然；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；2)发酵培养：将种子液以体积1-10％(优选4％)的接种量接种到发酵培养基中进行甘油批次发酵，在温度25-30℃、搅拌速率200-900rpm、通气量为2-4L/min/L起始发酵培养基条件下，发酵18-24h(优选温度为30℃，搅拌速率为300rpm，通气量为5m3/min)，发酵过程控制搅拌速率与溶解氧DO值偶联，使DO值大于20％，甘油会被耗尽，溶解氧DO值快速上升；开始进入甘油补料发酵阶段：其甘油补料培养基的补加速率为18-20mL/h/L起始发酵液体积，甘油补料培养基补加量为原始加入发酵培养基体积的15～20％，甘油会被耗尽，溶解氧快速上升，并继续饥饿培养1-2h；进入甲醇诱导发酵阶段，控制甲醇补料培养的补料速率为3.0-3.6mL/h/L起始发酵培养基，维持溶解氧DO大于10％，发酵2-3h，提高甲醇补料速率为5.0-7.2mL/h/L起始发酵培养基，发酵3-5h后，继续增加甲醇补料速率为9.0-10.2mL/h/L起始发酵培养基，持续发酵60-70h，发酵结束，获得含溶菌酶的发酵液；所述甲醇补料培养基补加量为原始加入发酵培养基体积的50～80％；所述发酵培养基质量终浓度组成：26.7ml/L的85％磷酸，0.93g/L的硫酸钙，18.2g/L的硫酸钾，14.9g/L的MgSO4·7H2O，4.13g/L的氢氧化钾，40g/L的甘油，4.35ml/LPTM1缓冲液，溶剂为去离子水，pH5.0；所述的甘油补料培养基是向质量浓度25％甘油中添加12ml/LPTM1缓冲液；所述甲醇补料培养基是向无水甲醇中添加12ml/LPTM1缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示蛋清溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。/n
【技术特征摘要】
1.一种含高拷贝数蛋清溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母工程菌是将SEQIDNO.1所示蛋清溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。
3.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述高拷贝数是指蛋清溶菌酶基因的拷贝数为13。
4.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法包括以下步骤：
1)将核苷酸序列SEQIDNO.1所示蛋清溶菌酶基因克隆到分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-EWlyz；
2)将重组质粒pPIC9K-EWlyz采用限制性内切酶SacI线性化后，转化毕赤酵母菌株中，通过高浓度G418抗性平板筛选、透明圈平板高通量筛选和三角瓶发酵，筛选得到拷贝数为5重组菌株，记为重组菌株EWC91；所述高浓度G418抗性平板是指含3.5g/L遗传霉素G418的YPD平板；
3)将pPIC9K-EWlyz上的蛋清溶菌酶基因表达阅读框克隆到pPICZαA质粒上，并构建含有4个拷贝数的重组表达质粒pPICZαA-EWlyz4；
4)将pPICZαA-EWlyz4采用限制性内切酶SalI线性化后，转化重组菌株EWC91，筛选得到蛋清溶菌酶基因的拷贝数为13的重组菌株，记为重组菌株IEF-ewlyz13。
5.一种权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌在发酵制备溶菌酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵方法如下：1)种子培养：将重组毕赤酵母工程菌接种到YPD平板上，25-30℃培养40h；将单菌落接种到种子培养基中，25-30℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述YPD平板组成如下：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱林江，周斌，陈小龙，陈艺强，陆跃乐，朱勇刚，陈翰驰，
申请(专利权)人：浙江新银象生物工程有限公司，浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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