一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法技术

本发明专利技术提供了一种高效合成α‑香树脂醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)构建的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术首先对来源于苹果(Malus domestica)的α‑香树脂醇合酶进行半理性设计，通过关键氨基酸残基位点饱和突变与迭代突变获得一系列突变体，其中包括催化活性最高的MdOSC1突变体。然后将α‑香树脂醇合成途径中的关键基因过表达，同时过表达二酰甘油酰转移酶(DGA1)，提高酿酒酵母细胞中α‑香树脂醇的存贮能力。本发明专利技术所述方法构建的高产α‑香树脂醇酿酒酵母工程菌株，产量达到213.79mg/L，实现了酿酒酵母中α‑香树脂醇的高效生产，该工程菌在生产中具有重要意义。

An efficient method for the construction of Saccharomyces cerevisiae

【技术实现步骤摘要】
一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法及应用。
技术介绍
α-香树脂醇是重要的乌索烷型五环三萜类化合物，具有多种常见的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫增强和肝脏保护，且具有最强的抗增殖活性。作为植物次生代谢产物，α-香树脂醇在植物的叶片、果实及根茎中广泛分布，但积累量微小。传统的化学合成与植物源提取效率低、得率有限，且周期长，污染严重。随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，构建异源基因整合的重组微生物工程菌可作为生产α-香树脂醇的解决方案以满足市场需求，具有可观的经济效益和社会效益。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为真核模式微生物，遗传背景清晰，基因操作简单，且具有完整的细胞内膜系统，其内源的MVA途径能够为萜类化合物提供更多的合成前体，被认为是萜类合成的适宜底盘宿主。截至目前，酵母已作为细胞工厂完成了大量的天然产物的生产。借助传统的代谢工程策略提高其产量，包括目标产物合成途径关键基因的过度表达、竞争途径的下调和平衡、途径中间体的利用等手段已被广泛应用，此外，提高酿酒酵母对疏水性化合物的储存能力可增加α-香树脂醇前体(3s)-2,3-氧化鲨烯的积累，有望提高α-香树脂醇的产量。更为重要的是，α-香树脂醇合酶的催化活性极大影响了α-香树脂醇产量，故我们对α-香树脂醇合酶进行(半)理性设计和改造，以提高酶的催化活性与特异性。我们采用的半理性设计方法，基于晶体结构和计算模型创建一个相对于定向进化小而精准的突变库，把活性位点和底物结合位点周围的残基作为诱变的最佳候选，修饰在后产生催化活性或特异性提高的α-香树脂醇合酶。通过在酿酒酵母中引入α-香树脂醇合酶实现植物天然产物α-香树脂醇的微生物生产，将蛋白质工程与代谢工程结合，进一步优化酿酒酵母细胞工厂，提高α-香树脂醇产量，这些研究都为利用酿酒酵母高效生产植物天然产物提供有价值的参考资料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法，包括高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建。如权利要求书1,2,3所示，酶的半理性设计，包括：对来源于苹果的α-香树脂醇合酶MdOSC1(Malusdomestica，GenBank注册序列号为ACM89977.1)进行半理性设计，借助在线工具Swiss-Model，以人源羊毛甾醇合酶(PDB:1W6K)的晶体结构为模板进行同源建模，同时利用在线工具Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)预测底物(3S)-2,3-氧化鲨烯的3D结构，利用Autodock1.5.6软件进行分子对接。如权利要求书1,2,4所示，α-香树脂醇合酶突变体的构建，包括：完成α-香树脂醇合酶MdOSC1与底物(3S)-2,3-氧化鲨烯进行分子对接后，选择距离底物结合结构域较近的序列(353DQIHYEDENSRYITIGCVEKPLMML377)、催化结构域附近的序列(249LPFHPSKMFCYCRLTYLPMS268)、以及N末端部分序列(2WKIKFGEGANDPMLFSTNNFHGRQ25)作为突变位点，对其进行丙氨酸扫描突变。在突变后催化活性明显增强的氨基酸残基中，选择活性中心附近的非极性氨基酸残基P250、P373与活性中心外的极性氨基酸残基N11进行饱和突变。如权利要求书1,2,5所示,高活性α-香树脂醇合酶突变体中一系列突变体的获得，包括：将催化活性较高的单点突变体N11I、P250N、P373A作为迭代突变体的候选突变位点，进一步组合，利用含有单点突变的α-香树脂醇合酶质粒为模板，构建α-香树脂醇合酶迭代突变体生成双突变体和三突变体，最终获得催化活性最高的α-香树脂醇合酶突变体MdOSC1-1。导入酿酒酵母原始菌株Insc1得到菌株aAM8，就在酿酒酵母中α-香树脂醇的产量而言，aAM8较导入MdOSC1基因的菌株MdOSC1提高了1310％。如权利要求书6,7所示，构建过表达α-香树脂醇合成途径中的关键酶的高拷贝质粒：在pYYG载体上构建α-香树脂醇合酶突变体MdOSC1-1表达盒。如权利要求书6,7所示，构建α-香树脂醇合成途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的过表达方法：构建PTEF1-HIS3-TADH1基因表达盒转化并整合到酿酒酵母Ⅻ染色体的rDNA位点，向其rDNA位点导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶表达盒PTDH3-tHMG1-THMG1和PTEF1-HIS3-TADH1。如权利要求书9所示，构建在基因组高拷贝位点整合酿酒酵母内源性二酰甘油酰转移酶(DGA1)的重组菌株，具体为：以酿酒酵母INVSc1(MATa/MATαhis3Δ1leu2trp1-289ura3-52)作为底盘宿主菌，通过同源重组技术向其Δ位点导入酿酒酵母内源性代谢相关基因二酰甘油酰转移酶(DGA1)表达盒，借此提高酿酒酵母对疏水性油脂类物质的储存能力，其中所构建的表达盒为“PADH1-DGA1-TDGA1”。如权利要求书8,10所示，所构建重组菌株，包括上述6,7,9全部整合，最终得到MVA途径强化表达与产物存储能力强化的酿酒酵母工程菌aAM15。实验证明，通过同源重组的方法，获得的α-香树脂醇高产工程菌aAM15，α-香树脂醇产量达到213.79mg/L，比未进行蛋白质工程与代谢工程改造菌株提高了93.6倍。本专利技术为酿酒酵母中α-香树脂醇的高效生产提供了依据与指导。本专利技术的酿酒酵母工程菌具有以下优点：1、本专利技术中α-香树脂醇合酶的表达利用半乳糖诱导，从而实现在特定阶段生产α-香树脂醇，降低α-香树脂醇对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞的伤害，提高产量。2、本专利技术利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为底盘宿主，通过半理性设计改造α-香树脂醇合酶，获得催化活性大幅度提高的突变体MdOSC1-1，可应用于下游其他代谢产物(如熊果酸等)的高效合成。3、本专利技术中酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)工程菌利用葡萄糖和半乳糖直接合成大量α-香树脂醇，实现了该种植物次生代谢产物在酿酒酵母中的高效合成，解决了早期化学合成和分离萃取产量低的问题，推动α-香树脂醇的工业化生产。附图说明图1为高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母细胞工厂的构建策略。图2为利用Pymol软件对α-香树脂醇合酶MdOSC1和(3S)-2,3-氧化鲨烯对接模型进行分析。图3为专利设计过程中构建的所有α-香树脂醇合酶MdOSC1突变体的产量情况。图4是专利构建中的酿酒酵母工程菌株生产α-香树脂醇的气相质谱分析检测和产量结果。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法。


2.如权利要求1所示，这种方法包括但不仅限于酶的半理性设计、提高α-香树脂醇合酶酶活、强化α-香树脂醇前体代谢途径、提高α-香树脂醇在酿酒酵母中的存贮能力等。


3.如权利要求1-2所示，酶的半理性设计包括借助在线工具Swiss-Model以人源羊毛甾醇合酶(PDB:1W6K)的晶体结构为模板进行同源建模、分子对接等设计突变位点。


4.如权利要求1-3所示，提高α-香树脂醇合酶酶活的方法包括但不仅限于高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建。


5.如权利要求1-4所示，高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建方法包括一系列突变体的获得，包括：
所述GenBank号为ACM89977.1所示的底物结合结构域氨基酸序列(353DQIHYEDENSRYITIGCVEKPLMML377)经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸得到的具有高活性的α-香树脂醇合酶MdOSC1衍生的蛋白质；
所述GenBank号为ACM89977.1所示的催化结构域氨基酸序列(249LPFHPSKMFCYCRLTYLPMS268)经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸得到的具有高活性的α-香树脂醇合酶MdO...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，余源，常鹏程，刘皓然，李春，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11