产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途制造技术

本发明专利技术公开了产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途，重组酵母构建：向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素‑NADPH‑还原酶1的编码基因表达盒，得到重组菌2，将编码3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的5'端截去1500个核苷酸，得到截短的编码3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1；导入重组菌2中，得到重组菌3。实验证明，通过同源重组的方法，获得重组菌使达玛烯二醇和原人参二醇的产量提高，本发明专利技术的方法为人工合成达玛烯二醇和原人参二醇提供了依据。

Recombinant yeasts for lipolysis producing diol and protopanaxadiol and its application

【技术实现步骤摘要】
产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途
本专利技术涉及生物
，尤其涉及异源合成达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途。
技术介绍
人参作为一种名贵中药材，无论在疾病治疗还是在保健方面，一直都是研究和应用热点。原人参二醇(Protopanaxadiol，缩写为PPD)以及PPD型人参皂苷是人参、红参等中药中的重要活性成分。现代医学研究表明，PPD具有较强的抗癌活性，可有效杀伤、杀死肿瘤细胞。由于人参中的PPD含量极少，不到人参干重的0.05％，因此，PPD的生产和制备主要来自于PPD型总皂苷的糖基水解、酶解获得，然而这类方法存在以下几个缺点。1)原料短缺。人参生长周期长，且易受到农药残留污染，导致产品品质无法满足国内外市场需求。2)人参提取物成分复杂，分离纯化成本较高。3)制备过程往往伴随着对环境的高污染。因此，利用合成生物学的方法，通过微生物发酵生产人参皂苷将从根本上解决上述问题。解脂耶氏酵母作为一种GRAS(generallyregardedassafe)非常规酵母，已有研究表明其适合作为萜类化合物生产底盘细胞。然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成达玛烯二醇和原人参二醇还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第二个目的是提供第二种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第三个目的是提供第三种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第四个目的是提供第四种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第五个目的是提供第五种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第六个目的是提供第六种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第七个目的是提供第七种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第八个目的是提供第八种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第九个目的是提供第九种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第十个目的是提供第十种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。本专利技术的第十一个目的是提供上述产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产达玛烯二醇和原人参二醇的用途。本专利技术的技术方案概述如下：第一种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌2)，用下述方法构建：向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示。第二种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌3)，用下述方法构建：(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；(2)将编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的5'端截去1500个核苷酸，得到截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的5'端1500个核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(3)将含有步骤(2)获得的基因tHMG1的表达盒导入重组解脂耶氏酵母菌2中，得到重组解脂耶氏酵母菌3。第三种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌4)，用下述方法构建：(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌4，所述氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1用SEQIDNO.6所示。第四种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌5)，用下述方法构建：(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌5，所述磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8用SEQIDNO.7所示。第五种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌6)，用下述方法构建：(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有鲨烯合酶的编码基因ERG9的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌6，所述鲨烯合酶的编码基因ERG9用SEQIDNO.8所示。第六种产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌(简称重组菌7)，用下述方法构建：(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示。


2.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：
(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；
(2)将编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的5'端截去1500个核苷酸，得到截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的5'端1500个核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
(3)将含有步骤(2)获得的基因tHMG1的表达盒导入重组解脂耶氏酵母菌2中，得到重组解脂耶氏酵母菌3。


3.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：
(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；
(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌4，所述氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1用SEQIDNO.6所示。


4.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：
(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；
(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌5，所述磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8用SEQIDNO.7所示。


5.产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征是用下述方法构建：
(1)向解脂耶氏酵母中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2，所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示，所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示，所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；
(2)向重组解脂耶氏酵母菌2中导入含有鲨烯合酶的编码基因ERG9的表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌6，所述鲨烯合酶的编码基因ERG9用SEQIDNO.8所示。


6.产达玛烯二醇和原人参...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，李大帅，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12