一种柚皮素产物成瘾装置及其应用制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种柚皮素产物成瘾装置及其应用，涉及生物化工技术领域，以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘，在工程化的黄酮类化合物合成菌株中构建产物成瘾装置。所述成瘾装置利用产物诱导型启动子控制底盘细胞存活基因的表达。在生产过程中，通过产物诱导存活基因表达，回补底盘细胞的营养缺陷型，从而使生产菌株对产物成瘾，即高产量的菌体具有较高的生长速率，低产量的菌体具有较低的生长速率，从而在发酵过程中淘汰低产量的突变菌体，富集高产量的菌体，使长期发酵及放大过程中菌株保持生产性状的稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种柚皮素产物成瘾装置及其应用
本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种柚皮素产物成瘾装置及其应用。
技术介绍
在发酵过程中，由于遗传和非遗传变异，导致原本表型一致的细胞群体发生分化，出现生产性能高、生产性能低甚至无生产能力的突变体。这种生产性能的降低或丢失的现象称为“逃逸”。由于逃逸的细胞负担更小，因此生长速率更高，并逐渐在发酵过程中处于优势地位，导致整体生产能力的下降甚至完全丧失。这种在长期发酵或发酵放大过程中出现的，低生产能力或无生产能力的细胞逐渐淘汰高生产能力的细胞的现象，也被称为“菌种退化”，然而其机理在最近几年才开始被深入研究。黄酮类化合物不仅对原生植物具有重要作用，而且对人类健康具有重要的生理功能。目前市场上的黄酮类化合物均直接或间接来源于植物提取，由于受到原生植物资源及提取成本的限制，这些化合物产量有限，且价格普遍较高。以微生物为底盘细胞合成黄酮类化合物，能够很好的解决上述问题。然而，由于黄酮类化合物对细胞生长的胁迫作用，及高度工程化底盘细胞的负担，导致黄酮类化合物生产菌株不稳定，生产性状退化明显。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种柚皮素产物成瘾装置及其应用，使得高产量的菌体具有较高的生长速率，低产量的菌体具有较低的生长速率，从而在发酵过程中淘汰低产量的突变菌体，富集高产量的菌体，使长期发酵及放大过程中菌株保持生产性状的稳定。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种柚皮素产物成瘾装置，所述柚皮素产物成瘾装置以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以质粒pYLXP’2为载体，将亮氨酸合成基因LEU2、柚皮素诱导型嵌合启动子和转录因子FdeR构建进所述底盘细胞中。优选的，所述亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母Po1f，基因型为MATAura3-302leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2。优选的，所述亮氨酸合成基因LEU2编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，所述亮氨酸合成基因LEU2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述柚皮素诱导型嵌合启动子包括：FdeR结合位点FdeO和启动子核心区；所述FdeR结合位点FdeO的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述转录因子FdeR的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述转录因子FdeR受启动子控制，所述启动子包括：组成型启动子POX4、IDP2或诱导型启动子OTEF。本专利技术还提供了所述柚皮素产物成瘾装置在维持柚皮素生产菌株稳定性中的应用。相比于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘，在工程化的黄酮类化合物合成菌株中构建产物成瘾装置。该成瘾装置利用产物诱导型启动子控制底盘细胞存活基因的表达。在生产过程中，通过产物诱导存活基因表达，回补底盘细胞的营养缺陷型，从而使生产菌株对产物成瘾，即高产量的菌体具有较高的生长速率，低产量的菌体具有较低的生长速率。在本专利技术实施例中，利用发酵放大模拟实验验证生产菌株的生产稳定性，对照菌株的菌体生长速率不断提高，而含有产物成瘾装置的菌株的生长速率则基本维持稳定；另一方面，对照菌株的柚皮素产量在300h后迅速下降，在650h后基本消失；而装配有产物成瘾装置的菌株则在整个发酵模拟过程中基本维持柚皮素生产性状的稳定性。可见，本专利技术所述柚皮素产物成瘾装置，可在发酵过程中淘汰低产量的突变菌体，富集高产量的菌体，使长期发酵及放大过程中菌株保持生产性状的稳定。附图说明图1为产物成瘾装置机制示意图；图2为不同强度的启动子控制FdeR基因表达及其成瘾效果；其中，a-c分别为不同的柚皮素成瘾装置示意图，d-f分别为装备有a-c对应装置的底盘细胞在不含柚皮素的亮氨酸缺陷型平板上的生长情况，g-i分别为装备有a-c对应装置的底盘细胞在含有柚皮素的亮氨酸缺陷型平板上的生长情况，j-l分别为装备有a-c对应装置的底盘细胞在亮氨酸缺陷型液体培养基中的生长情况；图3为产物成瘾装置对菌株生产性状稳定性分析图；其中，a为连续传代模拟发酵放大过程中菌体生长情况(OD600)，b为连续传代模拟发酵放大过程中柚皮素产量变化情况。具体实施方式本专利技术提供了一种柚皮素产物成瘾装置，所述柚皮素产物成瘾装置以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以质粒pYLXP’2为载体，将亮氨酸合成基因LEU2、柚皮素诱导型嵌合启动子和转录因子FdeR构建进所述底盘细胞中。本专利技术所述柚皮素产物成瘾装置的机制示意图如图1所示，利用产物诱导型启动子控制底盘细胞存活基因的表达。在本专利技术中，所述亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌优选为解脂耶氏酵母Po1f，其基因型为MATAura3-302leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2。本专利技术所述亮氨酸合成基因LEU2优选编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，所述亮氨酸合成基因LEU2的核苷酸序列优选如SEQIDNO.1所示。本专利技术以亮氨酸(Leu)缺陷型解脂耶氏酵母为底盘细胞，以LEU2基因的表达控制细胞生长，以嵌合启动子控制LEU2基因的表达。本专利技术所述柚皮素诱导型嵌合启动子优选包括：FdeR结合位点FdeO和启动子核心区；所述FdeR结合位点FdeO的核苷酸序列优选如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述启动子核心区优选包括TEF(111)、TEF(136)、LEU2(78)或GAPDH(88)，更优选为TEF(136)；所述的启动子核心区TEF(136)的核苷酸序列优选如SEQIDNO.3所示。在本专利技术中，所述转录因子FdeR为变构蛋白质，在柚皮素存在时与FdeO相结合，并激活下游基因转录；在柚皮素不存在时，与FdeO解离。本专利技术所述转录因子FdeR的氨基酸序列优选如SEQIDNO.4所示。本专利技术所述转录因子FdeR可以由组成型启动子POX4或IDP2控制，也可以由诱导型启动子OTEF(136)控制。在本专利技术中，所述组成型启动子POX4来自于质粒pYaliJ1，所述组成型启动子POX4的核苷酸序列优选如SEQIDNO.5所示；所述组成型启动子IDP2来源于质粒pYaliL1，所述组成型启动子IDP2的核苷酸序列优选如SEQIDNO.6所示；所述诱导型启动子OTEF(136)来源于质粒pOTEF(136)，所述诱导型启动子OTEF(136)的核苷酸序列优选如SEQIDNO.7所示。本专利技术所述柚皮素产物成瘾装置的制备方法并没有特殊限定，优选包括：将FdeR结合位点FdeO置于组成型启动子上游，构建柚皮素诱导型嵌合启动子，并将所述诱导型嵌合启动子克隆到载体pYLXP’2的AvrII/XbaI酶切位点之间，替换载体pYLXP’2中原有的TEF启动子；将LEU2基因插入到上述得到的载体质粒的SnaBI位点，得到质粒pOTEF(136)-LEU2。分别将转录因子编码基因克隆至质粒pYaliJ1、pYaliL1和pOTEF(136)的SnaBI位点，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柚皮素产物成瘾装置，其特征在于，所述柚皮素产物成瘾装置以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以质粒pYLXP’2为载体，将亮氨酸合成基因LEU2、柚皮素诱导型嵌合启动子和转录因子FdeR构建进所述底盘细胞中。/n

【技术特征摘要】
1.一种柚皮素产物成瘾装置，其特征在于，所述柚皮素产物成瘾装置以亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以质粒pYLXP’2为载体，将亮氨酸合成基因LEU2、柚皮素诱导型嵌合启动子和转录因子FdeR构建进所述底盘细胞中。


2.根据权利要求1所述柚皮素产物成瘾装置，其特征在于，所述亮氨酸缺陷型解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母Po1f，基因型为MATAura3-302leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2。


3.根据权利要求1所述柚皮素产物成瘾装置，其特征在于，所述亮氨酸合成基因LEU2编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，所述亮氨酸合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：许敬亮，徐鹏，吕永坤，熊文龙，阿拉牧，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41