重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，同源重组法构建外源磷酸胞苷胆碱转移酶基因CCT整合表达载体，并以CCT基因重组的工程菌为载体，成功将外源多肽引入重组的工程菌的体内。本发明专利技术的有益效果：实现了CCT的稳定、长久表达，且CCT的表达水平提高了1.5倍左右；与野生型菌株相比，卵磷脂及脂肪酸含量显著提高，电穿孔技术将外源多肽转入菌株胞内，外源多肽因其自身亲脂性而进入重组菌株的脂滴内，实现了外源多肽的成功包裹。小鼠口服整个携带胰岛素的菌株GM4‑CCT‑insulin 7天，发现小鼠血清和重要器官（肝、肺、脾、肾）中insulin的含量增加，糖尿病小鼠口服菌株GM4‑CCT‑insulin，其血糖显著降低，GM4‑CCT‑insulin作为外源性胰岛素具有显著的降血糖的作用。

Living cell liposomes carrying exogenous polypeptides by recombinant Rhodotorula glutinosa and its application

【技术实现步骤摘要】
重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体是涉及重组磷酸胞苷胆碱转移酶的粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用。
技术介绍
磷脂（Phospholipid）是生物膜的基本成分，在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧，由于水是极性的，当众多的磷脂分子位于水溶液表面时，磷脂与水分子相互作用后通常会形成微团、脂质体、磷脂双层3种形式的磷脂分子复合物结构。多肽类药物都是生物大分子,其共同特点是在生物体内不稳定,易于被蛋白水解酶降解,因而在生物体内的半衰期较短,口服给药生物利用率低，且患者依从性差，因而限制了其广泛应用。而用脂质体包裹后,可克服这些缺点。真核生物体内其磷脂的合成其起始物为3-磷酸-甘油，3-磷酸-甘油在转酰基酶及磷脂酸酶作用下转变成二酰甘油，而二酰甘油在不同的转酰基酶的作用下合成不同的磷脂。因此，为控制磷脂的合成，可以通过提高转酰基酶的活性而使得磷脂的合成增多。本实验室前期筛选到的一种炎症前期趋化因子拮抗肽H9，,此拮抗肽可特异阻断炎症前期趋化因子的分泌,生产成本低,特异性强、功效明确,安全可靠，已于2011年申请专利保护，申请号为201110150794.6。H22LP也是实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽，H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制人巨细胞病毒的作用。干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α-(白细胞)型、β-(成纤维细胞)型，γ-(淋巴细胞)型;同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。Ⅰ型干扰素包括IFN-α与IFN-β等。由人成纤细胞产生的称IFNβ；IFN-α主要由单核-巨噬细胞产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α；IFN-β主要由成纤维细胞产生。IFN-α/β二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。Ⅱ型干扰素：Ⅱ型干扰素即γ干扰素，主要由活化的T细胞（包括Th0、TH1细胞和几乎所有的CD8+T细胞）和NK细胞产生，是所谓的淋巴因子（LyTnPhokine）的一种。IFN-γ可以以细胞外基质相连的形式存在，故通过旁邻方式控制细胞生长，其可以分布在除成熟红细胞以外的几乎所有细胞表面。IFN-γ抗菌作用：IFN-γ能通过下调转铁蛋白受体减少细菌供铁量或通过诱导产生内源性NO直接抑制细胞内细菌，还能增加单核巨噬细胞的吞噬小体——溶酶体溶解细菌作用，通过以上途径共同达到消灭细菌的作用。IFN-γ抗寄生虫作用：干扰素可激活巨噬细胞（Mφ），活化的Mφ可表达高水平的诱导型-氧化氮合酶（iNOS）催化L-精氨酸产生NO，NO对接种病原体有抑制和杀伤作用。并据报道，IFN-γ能激活Mφ产生NO，同时促进NO合成作用受剂量依赖性，剂量越高作用越明显。Daubener等（2001）发现用IFN-γ刺激人脑微血管内皮细胞（HBMEC）能诱导其抗弓形虫病。IFN-γ刺激后的HBMEC能抑制弓形虫生长，提高TNF-α的出现，这与IDO的活性有关。另外，在HBMEC的培养中加入过量的色氨酸能完全抑制IFN-γ-TNF-α介导的抗弓形虫病，表明IDO能介导其保护性，并且据报道，IFN-γ依赖IDO的表达而起作用。IFN-γ的免疫调节作用：参与免疫调节的为干扰素为IFN-γ，又称为免疫调节作用干扰素。免疫调节干扰素可对IgG的Fc受体表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，K、NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力。IFN-γ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力。此外还可以通过增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。同时还可以刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力，活化NK细胞，增强其细胞毒作用等作用来参与免疫调节。IFN-γ的抗肿瘤作用：干扰素是一个在防御肿瘤发展的先天的和适应的必需细胞因子，IFN-γ由特异性抗原刺激T淋巴细胞产生，其结构与I型干扰素不同，不耐酸，为机体主要的巨噬细胞刺激因子，对机体免疫反应有多方面的调节作用。能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞、巨噬细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的活性，促进单核细胞循环，增强免疫细胞表面抗原和抗体的表达，刺激IL-2、肿瘤坏死因子、干扰素-α等细胞因子的产生，抑制肿瘤细胞分裂，诱导基因全成抗病毒蛋白等。Siegbert（2003）等发现，IFN-α对神经型胰腺肿瘤细胞有抗增殖的作用，且此种抗增殖反应与机能性和非机能性神经内分泌瘤是相似的。普通干扰素分子小、作用时间短，一般情况下，普通干扰素注射12小时后基本完全排出体外，因而需要多次注射，因此给患者带来了极大的痛苦。长效干扰素半衰期长，长效干扰素的半衰期长达40小时，可以在乙肝患者体内持续作用168个小时，因而，长效干扰素一周只需要注射一次，使用比较方便，而且提高了干扰素治疗的安全性，但长效干扰素价格相对较贵，这大大阻碍了干扰素的广泛应用。红酵母属属于半知菌亚门。呈圆形或卵圆形,菌落为红色。无性,多极出芽。无酒精发酵能力,不同化乳糖,分解脂肪。红酵母宜生长在25-30℃,偏酸性,有一定碳源和氮源的环境。红酵母是一类抗逆性较强的腐生菌,存在于自然界,广泛分布于各种生态环境中。粘红酵母的细胞圆形、卵形或长形。多边芽殖,有明显的红色或黄色色素,由荚膜而形成粘质状菌落。本属中有较好产脂肪的菌种,可由菌体提取大量脂肪。有的种对烃类有弱氧化作用,并能合成一胡萝卜素。该菌的变种能氧化烷烃生产脂肪,含量可达干生物量的。在一定条件下还能产生一丙氨酸和谷氨酸,产蛋氨酸的能力也狠强,可达干生物量的。该菌的另一个优势是可以在很多便宜的培养基上生长,如玉米粉,糖浆等另外还可以在糖蜜,豆粕,味精废水等工业废料上生长,并且可以达到很高的生物量,容易进行高密度培养。现已有报道证明该菌的生物量可达到OD600=80以上可以进行超高密度培养。发酵方面的相关报道证明粘红酵母有很高的生物量和甲经戊酸通量,而甲轻戊酸是合成并最终合成辅酶。、幽醇类、番茄红素、青篙素等次级代谢产物的必要前体物,是很有潜力的工业菌种。本实验室前期筛选到一株产脂能力较强的粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）GM4，其脂肪酸含量可以高达22.54%。并对筛选到的粘红酵母进行基因工程改造，即将脂质代谢的关键酶苹果酸酶ME转染到菌株体内使其高效表达，与野生菌相比，转化菌可以积累更多的脂质，通过气相色谱检测，其脂肪酸由棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸等组成。此实验中为提高粘红本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，其特征在于，以经磷酸胞苷胆碱转移酶基因工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进经磷酸胞苷胆碱转移酶基因工程的菌株体内。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，其特征在于，以经磷酸胞苷胆碱转移酶基因工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进经磷酸胞苷胆碱转移酶基因工程的菌株体内。


2.根据权利要求1所述的一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，其特征在于,所述的工程菌是粘红酵母菌GM4。


3.根据权利要求1所述的一种重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，其特征在于,所述的磷酸胞苷胆碱转移酶（CCT)由酿酒酵母CCT基因分离扩增得到。


4.根据权利要求3所述的一重组粘红酵母携带外源多肽的活细胞脂质体及其应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）抽提表达载体质粒；
（2）强启动子PGK1基因和CCT基因片段连接；
（3）PGK1-CCT片段与表达载体质粒进行双酶切反应后连接构建重组质粒pPGK1Z-rD-CCT。


5.根据权利要求1所述引入外源多...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，汪佳佳，利时雨，
申请(专利权)人：广州溯原生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44