UL16蛋白在制备促进细胞线粒体功能相关药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了UL16蛋白在制备促进胚胎干细胞体外分化的小分子药物，以及干细胞移植治疗神经系统退行性疾病的应用。本发明专利技术通过构建UL16质粒转染宿主细胞，发现UL16能够促进葡萄糖的有氧氧化和氧化磷酸化，激活细胞产能途经，从而提升胞内的ATP含量，改善线粒体的功能。最后通过构建UL16表达质粒转染小鼠胚胎干细胞，发现线粒体功能状态增强和能量代谢增强，可以促进干细胞分化。实现对分化缺陷状态的细胞和低分化率细胞的临床治疗，以及用于治疗细胞线粒体功能障碍或低下的相关疾病或病理、生理过程。

【技术实现步骤摘要】
UL16蛋白在制备促进细胞线粒体功能相关药物中的应用
本专利技术蛋白筛选和应用机制领域，更具体地说，本专利技术涉及一种蛋白UL16具有增强线粒体功能状态并增加干细胞分化效率的功能及其应用。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，为多种代谢性肝病的细胞替代治疗提供了种子细胞来源，使它成为研宄的热点，但是其诱导分化的低效率一直是难以解决的关键问题。在体外，小鼠细胞能定向分化成几乎所有类型的成体细胞；人细胞也能成功分化为神经元、肝细胞、内皮细胞、心肌细胞、胰腺细胞和造血细胞等多种类型细胞。体外研究表明,不同来源的干细胞都能向肝脏细胞方向分化,表达肝细胞相关的表面标志,具有一些肝细胞功能,但是分化效率低。近几年研究显示，干细胞分化与能量代谢有重要联系，能量代谢和细胞命运紧密相关.许多正常细胞在细胞分裂期增加氧耗和能耗,在此期间如果ATP合成不足,细胞将在没有任何DNA损伤的情况下静止于G1期。有报导指出线粒体氧化磷酸化的下调会造成体细胞和小鼠的早衰；而更有趣的是，最近众多研究者对成体/胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)的线粒体及能量代谢的研究发现线粒体的功能可能影响正常干细胞的增殖、分化潜能及生存期等。实验证明给衰老小鼠损伤组织植入人胚胎干细胞，胚胎干细胞有固有的抗衰老作用，可以产生可溶性的蛋白这种物质是MAPK路径中抗衰老的信号。线粒体参与多种细胞信号通路和代谢途径，在细胞代谢和抗病毒信号途径中发挥了几个关键功能，包括其在ATP产生中的核心作用，同时有许多报导阐述了线粒体在干细胞多能性维持的作用。因而线粒体功能发生障碍可加速哺乳动物衰老并引发许多相关生理病理缺陷。病毒也不例外的依赖宿主的线粒体相关的代谢通路，比如HSV-1依赖于宿主细胞的代谢网络为病毒复制提供能量和大分子前体。能够通过增加果糖-6-磷酸激酶（PFK-1）的活性来激活宿主细胞的糖酵解途径，使宿主细胞的葡糖糖摄取量增加、细胞的胞内ATP含量增加。由此可知，病毒蛋白与线粒体关系密切。我们发现这样一种线粒体定位的病毒蛋白UL16作为线粒体刺激因子，在抵抗线粒体功能障碍引发的衰老中发挥重要作用，并且应用到改善与线粒体功能障碍相关的生理病理进程中去。这为病毒蛋白作为有益于胚胎干细胞临床治疗的后期研究打开了新篇章。因此探讨UL16蛋白的免疫原性和诱导机体能量稳态的能力、预防或治疗新药作用的靶点等成为今后的重要研究方向之一。
技术实现思路
本专利技术发现一种疱疹病毒蛋白UL16在线粒体的功能作用并研究其作用机制，使其在疾病治疗中发挥作用。本专利技术发现病毒蛋白UL16可应用于制备治疗抗衰老、线粒体功能障碍或代谢综合征的药物。本专利技术还发现UL16可以应用于胚胎干细胞分化过程中，促进线粒体能量代谢。本章成功构建了UL16基因的原核表达质粒pET-31b(+)-UL16，转化入(DE3)表达宿主菌中。Westernblotting实验显示重组蛋白与预测的分子量大小一致，约为，主要以不溶的包涵体形式表达；与兔抗进行免疫印迹，能得到特异性的条带；纯化复性后的重组蛋白免疫新西南大白兔，制备兔抗多克隆抗体，制备的多克隆抗体可与重组蛋白发生特异性识别，表明重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，制备的多克隆抗体可用于后续基因功能的研究。相对于现有技术，本专利技术经实验发现，增强细胞葡萄糖有氧氧化，提高线粒体呼吸，对ATP能量代谢通路进行调控，因此，可实现对细胞衰老、线粒体功能障碍和代谢综合征等多种代谢相关疾病的治疗和预防。附图说明图1为实施例1UL16基因鉴定结果。图2为实施例1UL16蛋白电泳图。图3为实施例2重组质粒转染HEK293T细胞后的ATP水平。图4为实施例2免疫共沉淀结果UL16基因对葡萄糖代谢酶活力的影响。图5为实施例2UL16基因乳酸水平的影响。图6为实施例2UL16转染对葡萄糖消耗水平的测定。图7为实施例2重组质粒转染对线粒体数量的影响测定图8为实施例2重组质粒转染胚胎干细胞后的mtDNA水平。具体实施方式以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例11.实验方法和材料HSV-1的UL16表达质粒pET-31b(+)-UL16，表达载体pET-31b(+)购自Invitrogen公司，质粒pFLAG-CMV-2购自Sigma公司。单纯疱疹病毒F株（HSV-1F）、菌株DH5α受体菌和细胞均为本实验室保存。引物设计及合成根据NCBI上查询到的HSV-1UL16基因的序列，利用Primers5.0软件设计引物UL16-for和UL16-rev用于HSV-1UL16的扩增，引物由上海生工公司合成。表1-1构建所用引物1.2病毒扩增及模板制备取单层HEK293T细胞用于HSV-1病毒培养，当约有75％细胞发生病变时，收集并处理病毒液，最终获得HSV-1基因组并作为目的基因扩增模板。具体操作步骤如下：(1)取单层HEK293T细胞，弃去原细胞培养液，用PBS缓冲液反复冲洗3次，充分去除死亡或者未贴壁的细胞。（2）从-80℃冰箱中取出HSV-1病毒，并溶解。（3）取200μl病毒加入到细胞中，均匀混合，置于培养箱中。每隔15-20min摇匀一次，使病毒完全吸附细胞。（4）约2h后病毒可完成侵染细胞，加入4ml新鲜细胞培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。（5）第二天早，在倒置显微镜下观察细胞形态，约有75%的细胞变成圆形并且折光率增加，即说明病毒已成功侵染细胞。（6）用吸管充分吹打均匀后，每管200μl分装于冻存管中，-80℃保存备用。（7）取适量病毒液，在100℃水浴煮10min，然后12000rpm离心5min，离心沉淀即为目的基因扩增模板。基因的克隆利用引物UL16-for和UL16-rev(如表1-1)扩增HSV-1UL16目的基因，并纯化回收PCR产物。具体操作步骤如下：(1)PCR反应体系如下：10×PCRBuffer5.00μlDNA聚合酶0.25μldNTP(2.5mM)2.00μlMgCl21.50μlUL16-for(10μM)1.00μlUL16-rev(10μM)1.00μl模板4.00μlddH2O12.75μl总计25.00μlPCR条件设置：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，30个循环；72℃10min。PCR结束后，将PCR产物置于4℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。产物的回收及纯化使用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳验证PCR的产物。利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收、纯化。具体操作步骤如下：（1）电泳结束后，在紫外照射下用已灭菌的干净的切胶刀将含有DNA片段的亮条带的琼脂糖胶块切下。切胶时，尽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种疱疹病毒UL16基因的表达质粒以及与UL16基因活性片段或其相关核酸、蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种疱疹病毒UL16基因的表达质粒以及与UL16基因活性片段或其相关核酸、蛋白。


2.权利要求1所述表达UL16蛋白的质粒在制备治疗线粒体功能障碍或促进干细胞分化的药物中的应用。


3.权利要求1所述表达UL16蛋白的质粒可用于制备一种预防细胞线粒体功能障碍的药物，其特征在于，UL16基因的转染可以促进线粒体的能量代谢。


4.权利要求1所述表达UL16蛋白的质粒可用于制备一种干细胞促分化药物，其特征在于，包括有效剂量的UL16蛋白作...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，张倩，利时雨，
申请(专利权)人：广州溯原生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44