一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用，该葡萄汁酵母菌株在部分敲除编码α‑乙酰乳酸合成酶的ILV2基因后，可以同时降低双乙酰和高级醇含量，联合二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶过表达后，在发酵中对降低葡萄酒中的双乙酰含量有协同作用。利用该菌株发酵，提高了葡萄酒的风味质量，可酿造出风味优良且更有利于健康的葡萄酒。

A strain of Saccharomyces cerevisiae producing low diacetyl and high alcohol and its application

【技术实现步骤摘要】
一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用
：本专利技术属于生物工程和基因工程
，涉及工业微生物的育种及其应用，具体是涉及一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其在制备葡萄酒中的应用。
技术介绍
：葡萄酒是世界上最古老的具有浓厚文化底蕴的绿色保健饮料，也是现代生活中不可或缺的饮品。葡萄酒中的香气成分复杂多样，相对含量从每升几纳克到几百毫克不等，在葡萄酒的呈香过程中起到重要作用。双乙酰是葡萄酒中重要的风味物质，适量的双乙酰，会增加葡萄酒的香气，改善葡萄酒的风味，而当双乙酰含量过高时，就可能产生令人生厌的“馊饭味”，葡萄酒表现变质迹象。高级醇味道大多似酒精，持续的时间长，有后劲，在葡萄酒中高级醇和其它风味物质以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约。适量的高级醇和协调的组分比可以使酒的口感协调、柔和。高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质。另外，高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间较乙醇长，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，葡萄酒中的双乙酰和高级醇的含量必须控制在合适的范围内。目前对于双乙酰调控的研究主要集中在啤酒发酵过程中。啤酒中的双乙酰主要是由啤酒酵母细胞通过缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸(α-Acetolactate)分泌至细胞外，再经过非酶促的氧化脱羧反应合成的。α-乙酰乳酸由丙酮酸生成，关键酶是乙酰乳酸合成酶，该酶的编码基因是ILV2，去除或改变ILV2，可减少α-乙酰乳酸的生成，从而减少双乙酰的生成。刘光诚等人专利技术了七日酿酒法，即在糖化和发酵过程中加入具有超强的电子还原性和离子交换功能的陨水速成剂，大幅降低了双乙酰指标，改善啤酒的品质(中国专利，CN107619733A，2018-01-23)。赵云财等人制作一种富含α-氨基氮的啤酒专用麦芽糖浆，并用该麦芽糖浆作辅料生产啤酒，可以大幅度降低双乙酰含量，提高啤酒的非生物稳定性(中国专利，CN103571672A，2014-02-12)。李红等人采用含有适当浓度D-缬氨酸的13°P麦汁在适当条件下驯化酵母，从酵母泥中筛选出对D-Val敏感的菌株并进行发酵实验，检测敏感菌株双乙酰含量，其降低率可达到34.08％(中国专利，CN104877922A，2015-09-02)。但上述工艺和菌株主要用于啤酒上，并未将其应用于葡萄酒，而且菌株通过筛选突变而来，重复性差。另外，目前在葡萄酒发酵过程中主要通过工艺条件优化控制葡萄酒中高级醇的含量。徐燕等人将酵母菌接种量控制在3％-5％，发酵罐装液量控制在70％-80％；葡萄酒发酵过程中，发酵醪液pH值控制在3.2-4.0，发酵温度控制在22℃-25℃，发酵醪液α-氨基氮含量控制在180mg/L-195mg/L，发酵醪液含氧量控制在8mg/L-10mg/L；发酵培养12d-15d后，向发酵醪液中添加SO2，添加量为120mg/L-140mg/L，通过对影响葡萄发酵过程中高级醇生成量的几个因素的综合考量和配置，大幅度减少了葡萄酒中高级醇的含量，改善了红葡萄酒的口感(中国专利，CN108060039A，2018-05-22)，翟衡等人通过在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，筛选的低产高级醇的酵母菌种可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10％-15％左右(中国专利，CN103627646B，2015.05.13)。但是通过工艺控制，较难保持葡萄酒产品的风味稳定性；而通过压力筛选的突变菌株在压力去除的工业应用过程中很容易回复突变。故在葡萄酒酿造过程中，应用工业微生物育种构建调控双乙酰和高级醇的酵母菌株，是解决双乙酰和高级醇含量较高的问题根本方法，也是国内外提高酒类风味质量的重要研究方向。在酿酒过程中酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是传统普遍应用的酵母菌种，但研究发现，在现代葡萄酒发酵中的非酿酒酵母数量较高(每毫升106-108个细胞数量)且持续存在，其与酿酒酵母一样在产生酒精的同时对葡萄酒的风味和香气等感官特征有着重要的影响，这导致人们又重新看待这些酵母在酿酒中的作用。随着分子生物学技术的发展，利用基因工程改造非酿酒酵母，例如葡萄汁酵母获得具有新的理想特征的各种酵母菌种，酿造具有复杂口感、风格独特的葡萄酒将会成为现代葡萄酒产业发展的重要方向。
技术实现思路
：本申请发现，葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)是一种具有潜在的酿酒特性的非酿酒酵母，其在高产甘油和低产乙醇的同时，也能比酿酒酵母产生更多的芳香物质。利用分子育种技术构建同时调控双乙酰和高级醇葡萄汁酵母工业菌株，对提高葡萄酒的风味质量具有重要意义。因此，本专利技术的第一方面，提供一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株，所述菌株部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。优选的，所述菌株还过表达二羟异戊酸脱水酶和/或羟酸还原异构酶。优选的，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶和部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，或者，所述菌株过表达羟酸还原异构酶和部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。更优选的，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶、羟酸还原异构酶和部分敲除编码的α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。优选的，所述ILV2基因部分敲除为至少敲除一个等位基因，例如，敲除一个等位基因，敲除两个等位基因，敲除三个等位基因。所述低产双乙酰和高级醇葡萄汁酵母是在出发葡萄汁酵母菌株中部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，同时过表达分别由ILV3和ILV5编码的二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶所得。所述ILV2基因其GeneID为：855135，核苷酸序列如表中SEQNO:1所示；所述ILV3基因其GeneID为：853473，核苷酸序列如表中SEQNO:2所示；所述ILV5基因其GeneID为：851069，核苷酸序列如表中SEQNO:3所示。所述启动子PGK1其GeneID为：850370，核苷酸序列如表中SEQIDNO:4所示。优选的，所述出发酵母菌株为葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)CICC1465。本专利技术还提供一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：1、ILV2基因的部分敲除菌株的构建；优选的，采用多重基因中断技术阻碍α-乙酰乳酸合成酶的表达构建ILV2基因的部分敲除菌株；或者，所述方法还包括，2、过表达ILV3和/或ILV5的重组菌株的构建；优选的，构建ILV3、ILV5基因多拷贝表达载体构建过表达ILV3和/或ILV5的重组菌株。更优选的，所述构建方法包括：1)：ILV2基因的部分敲除菌株的构建：采用缩进式的引物设计方法，PCR扩增筛选标记基因，结合多重基因中断技术将标记基因整合至ILV2的等位基因，且应用Cre重组酶去除，构建部分敲除ILV2等位基因的菌株，优选的，所述部分敲除ILV2等位基因包括敲除一个、两个或者三个ILV2等位基因；2)：将基因ILV3和/或IL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株，其特征在于，所述菌株部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株，其特征在于，所述菌株部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。


2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述ILV2基因部分敲除为至少敲除一个等位基因。


3.如权利要求1-2任一所述的菌株，其特征在于，所述菌株还过表达二羟异戊酸脱水酶和/或羟酸还原异构酶。


4.如权利要求1-3任一所述的菌株，其特征在于，所述菌株部分敲除编码的α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因和过表达二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶。


5.一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株的构建方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，李凭，李彤，肖冬光，于爱群，郭学武，陈叶福，董健，林良才，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12