双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株及其构建方法和发酵工艺技术

本发明专利技术提供一种将含有乳糖酶基因的整合性质粒与游离型质粒相结合，构建一种组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶的重组毕赤酵母表达菌株，并利用此重组毕赤酵母高密度表达乳糖酶。本发明专利技术将含有乳糖酶基因的整合性质粒与游离型质粒相结合构建表达菌株，可使得表达菌株的乳糖酶表达量大大提高，该表达菌株通过高密度发酵，其分泌表达量可以达到8000ALU/mL以上，因此本发明专利技术的表达菌株能够在工业上应用，提高乳糖酶的工业生产量。

Construction and fermentation technology of Pichia pastoris with double enhanced acidic lactase

【技术实现步骤摘要】
双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株及其构建方法和发酵工艺
本专利技术涉及乳糖酶生物发酵技术，具体是涉及乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建，同时涉及该毕赤酵母表达菌株的发酵工艺。
技术介绍
乳糖酶，学名β-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶，是一种白色粉末，无味道，无嗅。乳糖酶通过特定条件水解半乳糖苷键，将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被肠道吸收。大量研究表明哺乳动物的乳糖酶活性随年龄的增长，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制。全世界乳糖酶缺乏的发生率在50％以上，而我国有90％左右成人缺乏乳糖酶。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹涨、肠鸣、肠绞痛直至发生水泻等症状，总称为乳糖不耐受症。1889年荷兰生物学家，Beijerincek首次报道了乳糖酶可水解乳糖。乳糖酶不仅能有效的改善乳糖吸收不良，还能大大减轻症状。乳糖酶存在于杏、桃等植物以及幼小哺乳动物的小肠中，有很多微生物经发酵可以产生乳糖酶。其中细菌中的乳酸菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、黄青霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母和热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链菌霉都能产出β-半乳糖苷酶。酵母菌是目前工业化生产乳糖酶的一个主要来源。1994年叶祝嵩等人筛选到一株经乳糖诱导能产生高活性乳糖酶的K.fagilig菌株，该菌株还可产生蔗糖酶、麦芽糖酶等双糖酶类，适应于乳糖酶缺乏者使用。商品乳糖酶的另一来源是霉菌。有关乳糖酶在食品工业中的应用研究引起了人们的极大关注，已经成为食品生物
的新热点之一。目前国内和国外还存在着很大的差距，乳糖酶并未在中国食品和乳品工业中得到广泛应用，主要原因是乳糖酶的单位产量较低，生产工艺复杂，成本高。因此寻找一种提取工艺简单、高产且具有食品安全性的生产方式仍然是目前乳糖酶研究的重要方向。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种将整合型的乳糖酶基因和游离型的乳糖酶基因相结合，构建一种组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶的重组毕赤酵母表达菌株，并利用此重组毕赤酵母高密度表达乳糖酶。本专利技术的目的之一是提供组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株。本专利技术的目的之二是提供组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，并通过高通量筛选的方法，筛出高表达的重组毕赤酵母菌株。本专利技术的目的之三是为了提高乳糖酶的工业生产量，提供了一种用于制备乳糖酶的重组酵母高密度发酵方法。提取pPIC9K-Lac的质粒，用BglII、SacI、SalI单酶切线性化，用酚抽提，乙醇沉淀，溶于15ul无菌水，通过电转的方法将线性化的质粒导入毕赤酵母中，然后先用MD,MM平板筛选(MM平板中加入X-Gal溶液)，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株。将上述筛出的酶活最高的菌株制备成酵母感受态，通过电转将游离型质粒pasegagce-Lacn导入进去，然后先用MD，MM平板筛选(MD，MM平板中都加入X-Gal溶液)，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株。利用上述重组酵母进行酸性乳糖酶的高密度发酵。将重组酵母接种培养，然后接入发酵罐中，通气搅拌培养，接种后在培养基中碳源耗尽后补加碳源50％(v/v)甘油，当OD达到170-250时停止补加甘油，开始进行诱导。整个发酵过程中溶氧需要保持在0％-40％，持续培养96h以上。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术将整合型的乳糖酶基因和游离型的乳糖酶基因相结合构建表达菌株，可使得乳糖酶的表达量大大提高，该表达菌株通过高密度发酵，其分泌表达量可以达到8000ALU/mL以上，因此本专利技术的表达菌株能够在工业上应用，提高乳糖酶的工业生产量。附图说明图1a、图1b为实施例1整合型酸性乳糖酶进行平板筛选的MM平板显色图，图中未打钩处都已显蓝色。图2a、图2b为实施例2整合和游离型酸性乳糖酶进行平板筛选的MD、MM平板显色图，图中打钩和画圈处都已显蓝色，打钩的比画圈的早一天显蓝色。图3a、图3b为实施例2整合和游离型酸性乳糖酶进行平板筛选的MD、MM平板显色图，图中未打钩处都已显蓝色。图4a和图4b为重组整合与游离型酵母菌株在发酵罐中乳糖酶的溶氧、OD、酶活结果。图5重组整合与游离型酵母菌株在发酵罐中发酵不同时间的乳糖酶蛋白量的SDS-PAGE，其中M：蛋白分子量Marker；lane1-7：12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h。图6a和图6b为整合型酵母在发酵罐中乳糖酶的溶氧、OD、酶活结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。以下实施例中涉及的试剂如下：酶和试剂盒：限制性内切酶(BglII、SacI、SalI)、质粒提取试剂盒。培养基：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。LLB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5％琼脂)10×YNB(13.4％的无氨基酸酵母氮源)：134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。500×生物素：生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存。10×葡萄糖：200gD-葡萄糖溶于1L水，过滤灭菌，4℃保存。10×甘油：100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存。MD培养基：琼脂糖10-30g/L、10×YNB5-20g/L、10×葡萄糖10-30g/L、500×生物素0.1-3g/L。MM培养基：琼脂糖10-30g/L、10×YNB5-20g/L、500×生物素0.1-3g/L、甲醇0.5-3％。BMGY培养基：酵母提取物5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，K2HPO40-10g/L，KH2PO45-20g/L，10×YNB5-20g/L，500×生物素0.1-3g/L，甘油0.5-5％。BMMY培养基：酵母提取物5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，K2HPO40-10g/L，KH2PO45-20g/L，10×YNB5-20g/L，500×生物素0.1-3g/L，甲醇0.5-3％。重组酵母发酵培养基：磷酸(85％)10-30ml/L，甘油2-10g/L，硫酸钾10-30g/L，氢氧化钾1-10g/L，二水硫酸钙1-5g/L，酵母粉1-5g/L，七水硫酸镁3-10g/L，消泡剂1-5ml/L。补料培养基：甘油500g/L。微量元素：五水硫酸铜1-10g/L，一水硫酸锰1-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述表达菌株同时含有整合型质粒和游离型质粒，且所述整合型质粒和游离型质粒均含有乳糖酶基因Lac。/n

【技术特征摘要】
1.双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述表达菌株同时含有整合型质粒和游离型质粒，且所述整合型质粒和游离型质粒均含有乳糖酶基因Lac。


2.根据权利要求1所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为GS115、SMD1168、KM71、X33酵母细胞中的一种。


3.含有Lac基因的表达载体，用于向毕赤酵母导入Lac基因。


4.权利要求1所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤包括：
(1)分别构建包含Lac基因的整合型质粒和包含Lac基因的游离型质粒；
(2)提取包含Lac基因的整合型质粒，将其线性化后导入毕赤酵母中，然后先用MD、MM平板筛选，其中MM平板中加入X-Gal溶液，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株；
(3)将筛出的酶活最高的菌株制备成酵母感受态，将包含Lac基因的游离型质粒导入进去；然后先用MD、MM平板筛选，其中MD、MM平板中都加入X-Gal溶液，进行初...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹阳，田健，张东风，诸辉，
申请(专利权)人：宁波希诺亚海洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33