一种生产麦角硫因的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产麦角硫因的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌S‑BCDE，将其接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达404mg/L。本发明专利技术提供了一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌S‑P

A method of producing ergot sulfur

【技术实现步骤摘要】
一种生产麦角硫因的方法
本专利技术涉及一种生产麦角硫因的方法，属于生物

技术介绍
麦角硫因(Ergothioneine，ERG)是一种天然氨基酸衍生物，是由组氨酸衍生而来的硫醇化合物，最初在1909年由TanretC从真菌Clavicepspurpurea(寄生在禾本科植物黑麦上的一种真菌)中分离得到。由于麦角硫因具有抗氧化、抗炎、保护细胞等生理功能，因此，其被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域。分枝杆菌、放线菌、蓝细菌和裂殖酵母等微生物均能合成麦角硫因，酿酒酵母、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌等微生物则不能合成麦角硫因。动物和植物也不能生物合成麦角硫因，但可从外界吸收并积累，其中，人获得麦角硫因的方式一般是通过膳食摄入，被摄入的麦角硫因会在人体特定组织和细胞中积累，进而发挥其生理功能。目前，生产麦角硫因的方法主要有提取法、化学合成法以及生物合成法。其中，提取法主要是通过对麦角、谷物等含有麦角硫因的植物进行分离提取以获得麦角硫因。但是，由于植物中麦角硫因的含量较低，利用此方法制备得到的麦角硫因杂质多、成本高、产出比低。因此，提取法很难实现大规模工业化生产。利用化学合成法合成麦角硫因则具有成本高、难度大的等缺陷。这主要由于合成左旋的麦角硫因十分困难，几种合成方法都因局部或全部外消旋化而没有达到预期的产量，合成的难点是很难制备原料2-巯基咪唑，且α位碳的酸性会使反应很容易发生外消旋作用。除此以外，利用化学合成法合成得到的麦角硫因安全性难以得到保证。因此，化学合成法也很难实现大规模工业化生产且利用化学合成法得到的麦角硫因也很难在食品、医药以及化妆品等领域实现广泛的应用。生物法则主要是通过将可产麦角硫因的微生物进行发酵以生产麦角硫因。与提取法和化学合成法相比，生物法具成本低、原材料易获得以及安全性高等优势。但是，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，例如，文献“HeterologousandHighProductionofErgothioneineinEscherichiacoli”中，RyoOsawa等人构建了一株可产麦角硫因的重组大肠杆菌，将此重组大肠杆菌摇瓶发酵72h，仅可使发酵液中麦角硫因的含量达24mg/L，产量过低。上述缺陷使得现有的生物法无法真正实现麦角硫因的大规模工业化生产，因此，急需找到一种可高产麦角硫因的微生物以克服上述缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶(EC2.1.1.44，L-histidineNalpha-methyltransferase，egtD)的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶(EC1.14.99.50，gamma-glutamylhercynylcysteineS-oxidesynthase，egtB)的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶(EC3.5.1.118，gamma-glutamylhercynylcysteineS-oxidehydrolase，egtC)的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶(EC4.4.1.36，hercynylcysteineS-oxidelyase，egtE)的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述L-组氨酸-α-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主，以pRS305质粒、pRS303质粒、pRS403质粒、pRS405质粒或pYC48质粒为载体表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因，以pRS305质粒、pRS303质粒、pRS403质粒、pRS405质粒或pYC48质粒为载体表达编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因和编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主，以pRS303质粒为载体表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因，以pRS305质粒为载体表达编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因和编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述pRS305质粒上的启动子PT7被替换为了启动子PTEF1、启动子PTEF2或启动子PADH1。在本专利技术的一种实施方式中，所述pRS303质粒上的启动子PT7被替换为了启动子PTEF1、启动子PTEF2或启动子PADH1。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子PTEF1的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子PTEF2的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子PADH1的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子PT7的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因之间连接有F2A序列。在本专利技术的一种实施方式中，连接在编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因之间的F2A序列的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因和编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因之间连接有P2A序列。在本专利技术的一种实施方式中，连接在编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因和编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因之间的P2A序列的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CEN.PK2-1C。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因、编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因。


2.如权利要求1所述的一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述L-组氨酸-α-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


3.如权利要求1或2所述的一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主，以pRS305质粒、pRS303质粒、pRS403质粒、pRS405质粒或pYC48质粒为载体表达编码L-组氨酸-α-甲基转移酶的基因和编码炔基半胱氨酸S-氧化物裂解酶的基因，以pRS305质粒、pRS303质粒、pRS403质粒、pRS405质粒或pYC48质粒为载体表达编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物合酶的基因和编码γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸S-氧化物水解酶的基因。


4.如权利要求1-3任一所述的一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母为宿主，以pRS303质粒为载体表达编码L-组...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，杜养标，王丽，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江苏瑞霆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32