一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一锅酶法制备DL‑丝氨酸的方法。该方法包括以下步骤：(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D‑苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D‑丝氨酸；(2)所述D‑丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL‑丝氨酸。本发明专利技术具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、三废排放小，适合大规模的工业化生产等优点。

One pot enzymatic synthesis of DL serine

【技术实现步骤摘要】
一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法
本专利技术涉及一种DL-丝氨酸的生物制备方法，尤其涉及一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，属于生物

技术介绍
丝氨酸(Serine)是天然存在的20种氨基酸之一，一般是指L-丝氨酸。DL-丝氨酸(DL-Serine)包含两个等量的光学异构体，是L-丝氨酸和D-丝氨酸1:1的混合物。DL-丝氨酸是脱羧酶抑制药盐酸苄丝肼的关键中间体，同时也是合成很多有机化合物的原料，其结构式如下所示：一般氨基酸的生产工艺无外乎四种：蛋白质水解提取法、化学合成法、生物发酵和生物酶催化法。丝氨酸虽然在某些蛋白质如丝胶蛋白中含量丰富，但以蚕茧衣水解制取丝氨酸，不但原料成本高昂，而且后续分离纯化也困难，导致总成本较高。现有DL-丝氨酸的生产工艺基本是以化学合成为主。化学合成法制备DL-丝氨酸，涉及反应步骤多，工艺复杂，反应总收率偏低；原料或中间产物具有毒性，不易分离，导致产品分离纯化困难，且对环境不友好；化学合成法制备DL-丝氨酸总成本目前还是偏高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法。为了实现上述的目的，本专利技术采取以下技术方案：一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D-苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D-丝氨酸；(2)所述D-丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL-丝氨酸。本专利技术的催化工艺路线如下所示：进一步地，在上述方法中，所述的重组D-苏氨酸醛缩酶由节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶重组获得。进一步地，在上述方法中，所述的重组丙氨酸消旋酶由假单胞菌MYb115来源的丙氨酸消旋酶、枯草芽孢杆菌来源的丙氨酸消旋酶或酵母来源的丙氨酸消旋酶重组获得。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)辅酶为磷酸吡哆醛(PLP)。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)催化转化的pH为6.0～9.0；优选的，pH为7.0～8.0。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)催化转化温度为30℃～40℃，反应时间为10～60min，优选为30min。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)中甲醛为37％的甲醛溶液，所述甘氨酸与甲醛溶液的质量比为3:0.2～0.3。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)进一步添加0.01mol/L～0.03mol/L的镁盐；所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁中的任意一种或多种组合。本专利技术中添加镁盐作为辅助因子，对该酶催化具体良好的促进作用。有助于酶更完全的把底物转化为产物，大大提高酶催化的速率，同时对酶的稳定性有一定的作用。进一步地，在上述方法中，所述步骤(2)反应温度为30℃～40℃，当转化甘氨酸浓度低于2g/L，将转化温度提高至45～50℃，继续反应3～5小时。本专利技术当转化甘氨酸浓度低于2g/L，将转化温度提高至45～50℃，更有利于丙氨酸消旋酶把D-丝氨酸完全消旋为DL-丝氨酸，有利于产品的比旋度在“0”。进一步地，在上述方法中，步骤(2)之后还包括后处理步骤，所述后处理步骤包括对步骤(2)得到的DL-丝氨酸转化液经微滤膜、纳滤膜以及精密过滤器过滤浓缩，离心，洗涤，获得DL-丝氨酸晶体。本专利技术DL-丝氨酸转化液经微滤膜主要是为了去除菌体；纳滤膜可以脱色和除杂，获得的清液经精密过滤器进入降膜浓缩，经过低温连续浓缩，当大量晶体出现时，浓缩液直接离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体，经检测符合成品标准。进一步地，在上述方法中，所述浓缩时温度控制在45～50℃。本专利技术在上述温度范围内能够得到小颗粒状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.5％以上，纯度达到99.95％以上。若温度偏高或者偏低，则得到片状或粉状晶体，透光率和纯度将远远降低。进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)得到D-丝氨酸可进一步经过后处理制备D-丝氨酸产品，同时得到D-丝氨酸残留母液，所述母液能够进一步经重组丙氨酸消旋酶消旋用于制备DL-丝氨酸。本专利技术D-丝氨酸残留母液经过重组丙氨酸消旋酶消旋，经过微滤膜去除菌体，以及纳滤膜脱色和除杂，清液经过精密过滤器进入降膜浓缩，经过低温连续浓缩，当大量晶体出现时，浓缩液直接离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体，经检测符合成品标准。经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.0％以上，纯度达到99.5％以上。本专利技术实现了D-丝氨酸母液的资源再利用，有效降低了D-丝氨酸生产过程中的“三废”排放。进一步地，在上述方法中，所述重组D-苏氨酸醛缩酶和重组丙氨酸消旋酶由如下方法制备：1)分别将来源于节杆菌的D-苏氨酸醛缩酶基因(DTA，GenBank:AB010956.1)、来源于假单胞菌MYb115的丙氨酸消旋酶基因(ALR，GenBank:PRA60187.1)构建到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DTA和pET28a-ALR；2)分别将上述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-DTA和BL21(DE3)/pET28a-ALR；3)将上述重组表达菌株单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃过夜培养；将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体TB培养基中，37℃振荡培养至OD600为3.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于25℃下诱导培养8-10h；离心，收集菌体，超声破壁后即分别获得重组D-苏氨酸醛缩酶和重组丙氨酸消旋酶的粗酶液。进一步地，在上述方法中，具体步骤如下：向反应体系中加入150g/L的甘氨酸和10～15g/L的37％甲醛溶液，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁3g/L、5-磷酸吡哆醛0.1g/L，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃，加入2％～4％重组D-苏氨酸醛缩酶，开始反应，反应过程中，pH会上升，流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间；反应30min后，投加0.5％～1％重组丙氨酸消旋酶；经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，且甘氨酸残留低于2g/L时，将转化温度提高至45～50℃继续反应3～5小时；反应结束后，获得DL-丝氨酸转化液。本专利技术一锅酶法制备DL-丝氨酸转化率≥98％，转化液中DL-丝氨酸含量可达100～140g/L。本专利技术具有以下技术特点：本专利技术的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法催化路线设计新颖，具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、三废排放小，适合大规模的工业化生产等优点。附图说明图1本专利技术催化生产的DL-丝氨酸的液相图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。本专利技术具体实施方式中使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一锅酶法制备DL‑丝氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D‑苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D‑丝氨酸；(2)所述D‑丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL‑丝氨酸。

【技术特征摘要】
1.一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D-苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D-丝氨酸；(2)所述D-丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL-丝氨酸。2.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述的重组D-苏氨酸醛缩酶由节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶重组获得。3.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述的重组丙氨酸消旋酶由假单胞菌MYb115来源的丙氨酸消旋酶、枯草芽孢杆菌来源的丙氨酸消旋酶或酵母来源的丙氨酸消旋酶重组获得。4.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)辅酶为磷酸吡哆醛(PLP)。5.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)催化转化的pH为6.0～9.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱敏帆，杨卫华，张飞龙，葛文强，金力，华超，肖延铭，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33