L-半胱氨酸的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供一种取代现有的发酵法的新的制造L‑半胱氨酸的方法。更具体而言，通过耐热性酶的组合，提供一种L‑半胱氨酸的制造方法。特别是课题在于，提供一种有效地制造由3‑磷酸甘油酸(3PG)经由磷酸羟基丙酮酸(HPV)合成O‑磷酸丝氨酸的通路的方法。本发明专利技术通过使源自嗜热菌的磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)及3磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)作用于3PG而生成O‑磷酸丝氨酸的O‑磷酸丝氨酸的制造方法及包含该工序的L‑半胱氨酸的制造方法来解决课题。

Production of L-cysteine

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】L-半胱氨酸的制造方法
本专利技术涉及作为氨基酸的一种的L-半胱氨酸的制造方法。
技术介绍
L-半胱氨酸为近年来市场急剧扩大的氨基酸，预测其市场今后也会由于世界人口的增加而持续扩大。L-半胱氨酸的主要的用途为用作食品添加物、药品、化妆品或谷胱甘肽、N-乙酰基-半胱氨酸、辅酶A的合成前体。作为L-半胱氨酸的制造方法，以从毛发或羽毛等的酸水解物的分离提取为中心，但近年也开始利用使用微生物的发酵法来制造。但是，利用微生物的发酵法存在如下的课题。已知有L-半胱氨酸的细胞内浓度的上升会引起(1)对微生物的增殖抑制和(2)对生物合成酶的反馈抑制。关于(1)，正在谋求通过L-半胱氨酸细胞外排泵蛋白的鉴定和该基因的表达强化来解决；关于(2)，正在谋求通过L-半胱氨酸生物合成酶的立体结构解析和反馈抑制机制的阐明、及基于其的非敏感性变异酶的研发的育种战略来解决。这样，正在尝试有效利用微生物的代谢功能、通过基因改造、育种等来提高生产率，但由于如上所述的课题，有时无法得到充分的生产率。(专利文献1～5)另外，正在进行使用源自微生物的酶制造各种有用物质(专利文献6、7)。用这种方法制造L-半胱氨酸时，有时在其过程中会合成O-磷酸丝氨酸。该O-磷酸丝氨酸由3-磷酸甘油酸(以下，原则上称为“3PG”)经由磷酸羟基丙酮酸(以下，原则上称为“HPV”)而合成。在非专利文献1中报道有源自作为超嗜热菌古生菌的东工大硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)的3-磷酸甘油酸脱氢酶(以下，原则上称为“PGDH”)，但仅在pH11这样的非常极端的条件且以促进二硫键的方式设计的大肠杆菌中过量表达的PGDH能确认到酶活性，在本来菌体可生存的中性附近的pH8.0几乎看不到活性。本申请专利技术人等对已经被注释(annotation)的源自ThermococcuskodakarensisKOD1的PGDH进行克隆，测定酶活性，但同样地单独时不能表现出活性。在这种背景中，为了适应今后需求的进一步增大而要求开发一种L-半胱氨酸的廉价且有效的制造方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2010-22215号公报专利文献2：WO2013/000864专利文献3：日本特开2009-232844号公报专利文献4：日本再表2012-137689号公报专利文献5：WO2012/152664专利文献6：日本特开2005-160371号公报专利文献7：日本特开2003-219892号公报非专利文献非专利文献1:1:ShimizuY,SakurabaH,DoiK,OhshimaT(2008)MolecularandfunctionalcharacterizationofD-3-phosphoglyceratedehydrogenaseintheserinebiosyntheticpathwayofthehyperthermophilicarchaeonSulfolobustokodaii.ArchBiochemBiophys.470(2):120-8.
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题本专利技术的课题在于，提供一种取代现有的发酵法的新的制造L-半胱氨酸的方法。更具体而言，通过耐热性酶的组合，提供一种L-半胱氨酸的制造方法。特别是课题在于，提供一种有效地制造由3PG经由HPV而合成O-磷酸丝氨酸的通路的方法。用于解决问题的技术方案本专利技术人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现一种L-半胱氨酸的制造方法，所述制造方法将耐热性酶组合并利用体外构建任意的人工代谢通路的技术。本专利技术的概要如下：(1)使源自嗜热菌/超嗜热菌的耐热性酶基因在大肠杆菌那样的通用的且中温性的微生物宿主内表达。(2)将得到的重组菌体或来自菌体的提取液供于60～90℃左右的热处理，使源自宿主的酶失活，同时部分地破坏宿主的细胞结构，从而制成底物/产物的透过性得到提高的催化剂组件。(3)将这些组件组合，构建体外人工代谢通路。另外，关于O-磷酸丝氨酸的合成，可以通过将源自异种菌株的PGDH和磷酸丝氨酸氨基转移酶(以下，原则上称为“PSAT”)而表现出活性。可知：就O-磷酸丝氨酸的合成而言，PGDH和PSAT单独时均不起作用，但组合则显示活性。这样，本专利技术的课题在于，提供一种取代现有的发酵法的新的制造L-半胱氨酸的方法。更具体而言，通过耐热性酶的组合，提供一种L-半胱氨酸的制造方法。特别是发现一种由3PG经由HPV而制造作为L-半胱氨酸的前体、即O-磷酸丝氨酸的方法。更具体而言，提供如下的专利技术。(1)一种O-磷酸丝氨酸的制造方法，使源自嗜热菌的3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)及磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)作用于3-磷酸甘油酸(3PG)，生成O-磷酸丝氨酸；(2)一种L-半胱氨酸的制造方法，其为制造L-半胱氨酸的方法，其包含(1)的制造工序；(3)根据(2)所述的制造方法，其特征在于，进一步添加谷氨酸脱氢酶(GDH)或NADH氧化酶(以下，“NOX”)而制造。专利技术效果根据本专利技术，可以通过使用由微生物粗纯化而得的耐热性酶来体外制造L-半胱氨酸。因此，在发酵法中成为课题的L-半胱氨酸导致的生长抑制不再成为问题。另外，在本专利技术中，可以通过将酶组合而自由地设计通路，因此，能够设计成不经由会受到L-半胱氨酸的反馈抑制的酶反应的方式(图1)。附图说明图1是L-半胱氨酸制造的代谢通路例。图2是PGDH的活性测定。图3是PSAT的活性测定结果。图4是反应液中的NADH及α-KG的浓度。图5是PGDH的活性。图6是添加辅酶再生系统的研究。图7是半胱氨酸生产试验的经时变化。具体实施方式本专利技术为一种O-磷酸丝氨酸的制造方法，其使源自嗜热菌的磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)及3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)作用于3-磷酸甘油酸(3PG)，生成O-磷酸丝氨酸。进一步为包含上述的工序的L-半胱氨酸的制造方法。O-磷酸丝氨酸由3PG经由HPV而合成。该通路中使用的酶为PGDH及PSAT。本专利技术中所使用的3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)为将3PG变换为HPV的氧化还原酶。如果该酶源自嗜热菌，则其结构等没有特别限定。在本专利技术中，嗜热菌为表达在60℃以上、特别是70～110℃下不变性且可以保持活性的酶的菌。作为嗜热菌，例如为：栖热菌属(嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、水生栖热菌(Thermusaquaticus)等)、热孢菌属(莱廷格热袍菌(Thermotogalettingae)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、嗜岩热孢菌(Thermotogapetrophila)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)等)、热球菌属(Thermococcusprofundus、Thermococcuskodakarensis、Thermococcusgammatolerans等)、火球菌属(掘越氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)、甘氏火球菌(Pyrococcusglycovorans)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、沃氏火球菌(Pyrococcuswosei)等)、硫化叶菌属(东工大硫化叶菌(Sul本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种O‑磷酸丝氨酸的制造方法，其中，使源自嗜热菌的磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)及3‑磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)作用于3‑磷酸甘油酸(3PG)，生成O‑磷酸丝氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.21 JP 2016-1847431.一种O-磷酸丝氨酸的制造方法，其中，使源自嗜热菌的磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)及3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)作用于3-磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：本田孝祐，井村诚，岩切亮，
申请(专利权)人：兴人生命科学株式会社，国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP