一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法技术

本发明专利技术提供了一种提高L‑异亮氨酸产量的发酵方法，所述方法包括以下步骤：(1)将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液1；(2)将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液2；(3)先将种子液2接种于发酵培养基中，再继续接种种子液1，经过发酵培养得到发酵液。本发明专利技术通过联合使用乳糖发酵短杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液明显提高了糖酸转化率和L‑异亮氨酸的产量，而且通过进一步的控制乳糖发酵短杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵过程中的用量比，再次提升了糖酸转化率和L‑异亮氨酸的产量。

A Fermentation Method for Increasing L-Isoleucine Production

The invention provides a fermentation method for improving L isoleucine production. The method comprises the following steps: (1) inserting Brevibacterium lactofermentation into seed medium for expansion, and obtaining seed liquid 1; (2) inserting Lactobacillus rhamnosus GG into seed medium for expansion, and obtaining seed liquid 2; (3) first inserting seeds into seed medium; Seed liquid 2 was inoculated in fermentation medium, then seed liquid 1 was inoculated again, and fermentation liquid was obtained. The invention improves the conversion rate of sugar and acid and the production of L-isoleucine by using lactose fermentation Brevibacterium seed liquor and Lactobacillus rhamnosus seed liquor, and further improves the conversion rate of sugar and acid and the production of L-isoleucine by controlling the dosage ratio of Brevibacterium lactose fermentation and Lactobacillus rhamnosus in the fermentation process.

【技术实现步骤摘要】
一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种提高L-异亮氨酸产量的方法。
技术介绍
L-异亮氨酸(L-Isoleucine)的化学名为L-a-氨基-β-甲基戊酸，是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，在国外，L-异亮氨酸还被大量用于乳牛催乳、制备饲料添加剂以及生产功能饮料。因其特殊的结构和功能，L-异亮氨酸在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，由于提取法和化学合成法生产的L-异亮氨酸与它的异构体分离困难，因而均未能实现工业化生产。目前在工业生产上实施的只有发酵法。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸的过程，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。由于前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用添加前体物发酵法生产L-异亮氨酸。直接发酵法是借助于微生物所具有的合成自身所需氨基酸的能力，达到过量积累某种氨基酸的目的。该法具有原料成本低，来源广泛，产品纯度高，反应条件温和等优点，具有工业化生产的潜力。现有的L-异亮氨酸生产菌主要有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌，其中，除谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌外，其余均的产酸能力均十分低下，只有谷氨酸棒杆菌与黄色短杆菌的三分之一到二分之一。为提高谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等的产酸水平，已经有许多学者从菌株的角度，试图通过突变菌株、构建基因工程菌得到产酸水平提高的谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等。中国专利公布CN1834228公开了黄色短杆菌突变株及其在发酵法生产L-异亮氨酸中的应用：以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC10135)为出发菌种，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-异亮氨酸生产菌株TC21，其遗传标记为蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)，使其具有L-异亮氨酸的生物合成能力。使用该突变菌株进行L-异亮氨酸生产，产酸率和糖转化率均达到了国内领先水平。但是，由于突变菌株的正向突变率极低、基因工程菌的构建也具有不确定性，因此，急需找到新的提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等菌产酸水平的思路。中国专利公布CN104878051A公开了一种通过添加胆碱提供L-异亮氨酸发酵产量的方法，在发酵培养基中添加胆碱，促进甲基合成、调节菌体细胞内渗透压、调节菌体脂肪代谢和蛋白质合成等作用，提高了L-异亮氨酸发酵生产的水平。但是这种方法对酸产量和糖转化率的提升效果极为有限。所以，目前需要一种L-异亮氨酸产量高、糖酸转化率高的高效发酵生产方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法，该方法不涉及微生物的变异，在保证较高酸产量和糖酸转化率的同时，具有良好的稳定性。说明：1、接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例；2、总接种量是指移入两种种子液的体积之和与接种后培养液体积的比例。本专利技术提供了一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法，所述方法包括以下步骤：(1)将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液1；(2)将鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液2；(3)先将种子液2接种于发酵培养基中，再继续接种种子液1，经过发酵培养得到发酵液。所述步骤(1)中种子培养基包含：葡萄糖95-98g/L、硫酸铵7-10g/L、蛋白胨95-99g/L、硝酸铵4-8g/L、磷酸二氢钾3-4g/L、硫酸镁1-2g/L。所述步骤(2)中种子培养基包含：葡萄糖20-50g/L、酵母膏2-8g/L、大豆蛋白胨15-25g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、硫酸镁0.5-1.2g/L、氯化钠0.4-1.0g/L。所述步骤(1)中的扩培温度为30-32℃，时间为16-18h，转速为210-290rpm。所述步骤(2)中的扩培温度为30-32℃，时间为12-15h，转速为100-130rpm。所述步骤(3)中发酵培养基包含：葡萄糖2000-2500g/L、硫酸铵10-380g/L、牛肉膏300-480g/L、磷酸二氢钾2-18g/L、硫酸镁2-8g/L。所述步骤(3)中发酵培养的温度为28-35℃、时间65-78h、转速为120-135rpm。所述步骤(1)中种子培养基的pH为6.2-6.7，所述步骤(2)中种子培养基的pH为7.0-7.2。所述步骤(1)中的接种量以乳糖发酵短杆菌菌粉计为0.1g/L，所述步骤(2)中的接种量以鼠李糖乳杆菌菌粉计为0.05g/L。所述步骤(3)中发酵培养基中接种的种子液1和种子液2的体积比为5-15:1。优选地，所述步骤(3)中发酵培养基中接种的种子液1和种子液2的体积比为5-10:1。所述步骤(3)中的总接种量为5-8％。所述步骤(3)中，在接种种子液2以后的10-40min接种种子液1。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术通过联合使用乳糖发酵短杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液明显提高了糖酸转化率和L-异亮氨酸的产量，而且通过进一步的控制乳糖发酵短杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵过程中的用量比，再次提升了糖酸转化率和L-异亮氨酸的产量。(2)本专利技术通过控制乳糖发酵短杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液在发酵培养基中的接种顺序，明显提高了糖酸转化率，提高了原料的有效利用率。具体实施方式除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的常规技术手段进行。实施例1一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法(1)将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液1，其中，种子培养基包含：葡萄糖95g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨95g/L、硝酸铵8g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁2g/L，扩培温度为30℃，时间为18h，转速为210rpm，种子培养基的pH为6.7，接种量以乳糖发酵短杆菌菌粉计为0.1g/L；(2)将鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG)接入种子培养基中进行扩培，得到种子液2，其中，种子培养基包含：葡萄糖50g/L、酵母膏2g/L、大豆蛋白胨25g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1.2g/L、氯化钠0.4g/L，扩培温度为32℃，时间为12h，转速为130rpm，种子培养基的pH为7.2，接种量以鼠李糖乳杆菌菌粉计为0.05g/L；(3)先将种子液2接种于发酵培养基中，10min后接种种子液1，经过发酵培养得到发酵液，其中，发酵培养基包含：葡萄糖2500g/L、硫酸铵10g/L、牛肉膏480g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁8g/L，发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高L‑异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将乳糖发酵短杆菌接入种子培养基中进行扩培，得到种子液1；(2)将鼠李糖乳杆菌接入种子培养基中进行扩培，得到种子液2；(3)先将种子液2接种于发酵培养基中，再继续接种种子液1，经过发酵培养得到发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种提高L-异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将乳糖发酵短杆菌接入种子培养基中进行扩培，得到种子液1；(2)将鼠李糖乳杆菌接入种子培养基中进行扩培，得到种子液2；(3)先将种子液2接种于发酵培养基中，再继续接种种子液1，经过发酵培养得到发酵液。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子培养基包含：葡萄糖95-98g/L、硫酸铵7-10g/L、蛋白胨95-99g/L、硝酸铵4-8g/L、磷酸二氢钾3-4g/L、硫酸镁1-2g/L。3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤(2)中种子培养基包含：葡萄糖20-50g/L、酵母膏2-8g/L、大豆蛋白胨15-25g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、硫酸镁0.5-1.2g/L、氯化钠0.4-1.0g/L。4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤(1)中的扩培温度为30-32℃，时间为16-18h，转速为...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶朋，陈峰，钟迎东，马婷，马光辉，
申请(专利权)人：内蒙古拜克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15