发酵生产L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及发酵生产L‑氨基酸的方法，所述L‑氨基酸选自L‑赖氨酸、L‑苏氨酸和L‑异亮氨酸，所述方法包括在合适的条件下培养具有在合适的培养基中分泌所述L‑氨基酸的能力的棒杆菌属细菌以及在培养基中累积所述L‑氨基酸以形成含L‑氨基酸的发酵液的步骤。所述细菌包含编码赋予对林可酰胺抗性的多肽的多核苷酸，所述多肽已经通过缺失或替换至少部分所述多核苷酸和编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因的至少一个拷贝而被修饰。

【技术实现步骤摘要】
发酵生产L-氨基酸的方法本专利技术涉及发酵生产选自L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的方法，所述方法包括在合适的条件下在合适的培养基中培养具有分泌所述L-氨基酸能力的棒杆菌属细菌的以及在培养基中累积所述L-氨基酸以形成含有L-氨基酸的发酵液的步骤。L-氨基酸用于人类医学、制药工业、食品工业，特别是用于动物营养。L-氨基酸，例如L-赖氨酸，是通过发酵棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的菌株而产生的。由于在经济上的重要性，不断地改良生产方法。所述改良可涉及发酵技术，例如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的成分，例如发酵期间的糖浓度，或者涉及将发酵液加工为合适产物形式，例如通过干燥和粒化发酵液或者通过离子交换层析进行加工，或者可涉及微生物自身的固有性质。用于改良这些微生物性质的方法是诱变、选择和筛选突变体。以此方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于调节重要性的代谢物是营养缺陷型的，并产生L-氨基酸。熟知的抗代谢物是L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(见例如Tosakaetal.:AgriculturalandBiologicalChemistry42(4),745-752,(1978))。重组DNA技术方法多年来也用于棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌的L-氨基酸生产菌株的菌株改良，通过修饰即增强或减弱各个L-氨基酸生物合成基因及研究对L-氨基酸生产的影响进行改良。已经分别揭示了棒杆菌属细菌或谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列及其分析。这个信息可在可公开访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。这样的数据库之一是NCBI的GenBank数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation,U.S.NationalLibraryofMedicine8600RockvillePike,BethesdaMD,20894USA)。在生物体的测序染色体的注释程序期间，数据库信息提供者为所鉴定的结构如基因或编码序列提供称为locus_tag的独特标识符。谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由Ikeda和Nakagawa(AppliedMicrobiologyandBiotechnology62,99-109(2003))及在EP1108790A2中描述。其在NCBI可以登录号NC_003450获得。Locus_tagNCgl2592标识编码“主要促进子超家族通透酶”的序列。谷氨酸棒杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析由Yukawaetal.(Microbiology153(4):1042-1058(2007))描述。其在NCBI可以登录号AP009044获得。Locus_tagcgR_2586标识编码假设蛋白质的序列。Lvetal.(JournalofBacteriology194(3),742-743(2012)描述了谷氨酸棒杆菌ATCC14067的染色体测序，这是先前称作黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)的菌株。其在NCBI可以登录号AGQQ02000001和AGQQ02000002获得。Locus_tagKIQ_001365标识编码“MFS转运蛋白通透酶”的序列。先前称作乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的核苷酸序列及其分析由Chen等揭示，在NCBI登录号为NZ_CP016335。Locus_tagBBD29_13115标识编码“MFS转运蛋白通透酶”的序列。Kimetal.(MoleculesandCells12(1),112-116(2001))鉴定了谷氨酸棒杆菌的lmrB基因，其编码赋予林可酰胺类如林可霉素和克林霉素抗性的蛋白质。作者使用的谷氨酸棒杆菌菌株称作ASO19E12。菌株ASO19E12源自ATCC13059(见：Follettieetal；JournalofBacteriology175(13),4096-4103(1993))。Kim等提示林可霉素抗性是能量依赖性流出系统。所述lmrB基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列可在NCBI的GenBank数据库获得，登录号为AF237667。该序列也在序列表中以SEQIDNO:1示出。林可霉素是由林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)产生的林可酰胺类抗生素。CAS(化学文摘服务)注册号为154-21-2。相应的盐酸盐的CAS注册号是859-18-7。克林霉素是林可霉素的氯化衍生物。CAS注册号为18323-44-9。相应的盐酸盐的CAS注册号是21462-39-5。关于抗生素的概述可见于教科书JasonC.GallagherandConanMacDougall(AntibioticsSimplified,2ndedition,Jones&BartlettLearning,2012)。棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌在其染色体中含有编码赋予选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺类抗生素抗性的多肽的基因。Nakagawa揭示了GenBank登录号BAC00079的定义为谷氨酸棒杆菌ATCC13032的“主要促进子超家族通透酶”的蛋白质的编码的氨基酸序列。该序列也在本说明书的序列表中以SEQIDNO:2示出。发现条目AF237667和BAC00079的氨基酸序列是全长相同的。也发现所述两个氨基酸序列与WO2001000804A2中SEQIDNO:2揭示的ATCC13032蛋白质的氨基酸序列是相同的(也见GenBank登录号CAC26288)。WO2001000804A2的SEQIDNO:2所示的氨基酸序列与本说明书序列表中SEQIDNO:8所示氨基酸序列相同。Nishio等揭示了GenBank登录号BAV24312的定义为Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentum菌株AJ1511的“林可霉素抗性蛋白lmrB”的蛋白质的编码的氨基酸序列。该序列也在本说明书的序列表中以SEQIDNO:3示出。Chen等揭示了GenBank登录号ANU34602的定义为谷氨酸棒杆菌ATCC13869的“MFS转运蛋白通透酶”的蛋白质的编码的氨基酸序列。这个菌株在先前称作乳糖发酵短杆菌。这个序列在本说明书的序列表中也以SEQIDNO:4示出。发现条目ANU34602和BAV24312的氨基酸序列是全长相同的。当与相应的ATCC13032多肽的氨基酸序列比较时，发现相同性为99.2％。Yukawa等揭示了GenBank登录号BAF55600的具有称作“MFS”区域的谷氨酸棒杆菌R的“假定蛋白cgR_2586”的编码的氨基酸序列。BAF55600中揭示的氨基酸序列也在序列表中以SEQIDNO:5示出。其与相应的ATCC13032的氨基酸序列的相同性为96.7％。术语“MFS”是“主要促进子超家族”的缩写。根据在NCBI的保守结构域数据库(见数据库条目cd06174)，该术语表示一组较大且多样的二级转运蛋白，包括单向转运蛋白、协同转运蛋白和反向转运蛋白，其促进各种物质包括离子、糖磷酸盐、药物、神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产选自L‑赖氨酸、L‑苏氨酸和L‑异亮氨酸的L‑氨基酸的方法，包括以下步骤：a)培养棒杆菌属细菌，所述细菌在合适的条件下在合适培养基中能分泌所述L‑氨基酸，b)在培养基中累积所述L‑氨基酸以形成含有L‑氨基酸的发酵液，其中在所述细菌中，所述多核苷酸通过缺失或替换编码与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少90％相同且赋予对选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺抗性的多肽的多核苷酸的至少部分而被修饰，且其中所述细菌包含至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因。

【技术特征摘要】
2017.10.05 EP 17194981.11.一种发酵生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的方法，包括以下步骤：a)培养棒杆菌属细菌，所述细菌在合适的条件下在合适培养基中能分泌所述L-氨基酸，b)在培养基中累积所述L-氨基酸以形成含有L-氨基酸的发酵液，其中在所述细菌中，所述多核苷酸通过缺失或替换编码与SEQIDNO:8所示的氨基酸序列至少90％相同且赋予对选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺抗性的多肽的多核苷酸的至少部分而被修饰，且其中所述细菌包含至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因。2.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过缺失相应于SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的位置1-258的氨基酸的所述多核苷酸的编码序列的部分中的至少一或两个核苷酸而被修饰。3.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过缺失相应于SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的位置210-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·贝克尔，G·蒂尔巴赫，K·福斯，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE