一种突变型酮还原酶及其在高制造技术

本发明专利技术公开了一种突变型酮还原酶及其在高

【技术实现步骤摘要】
一种突变型酮还原酶及其在高pH催化条件下的应用


[0001]本专利技术涉及生物酶催化领域，具体地说涉及一种突变型酮还原酶及其在高
pH
环境下作为
R
构型酮还原酶上的应用
。

技术介绍

[0002]维贝格龙
(Vibegron)
作为一种具有很强选择性的新型小分子
β
‑3肾上腺素受体激动剂，可显著减轻膀胱过度活动症
(OAB)
的症状
。
维贝格龙重要的合成中间体为叔丁基
((1R,2R)
‑1‑
羟基
‑1‑
苯基己基
‑5‑
炔
‑2‑
基
)
氨基甲酸酯，该中间体的手性纯度决定了维贝格龙成品的产品质量
。
该中间体分子结构复杂，化学合成污染严重且难度较高，其存在两个手性中心，其中一个手性中心连有羟基基团，另一个手性中心连有
NHBoc
基团
。
如采用生物催化技术，同时将两个手性中心转化为
R
构型存在较大困难，因为连有
NHBoc
基团的手性中心只有在高
pH
条件
(
特别是
pH
大于
10
的情况下
)
下才可以进行有效的转化，而大多数酮还原酶都不具备高
pH
耐受性，因此收率和手性纯度都非常低
。
类似的需求在其他药物合成的场景中也都有体现
。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种具有高
pH
耐受性，可将其中一个具有羰基的手性中心还原为
R
构型羟基，且能将另一个含有
NHBoc
基团的手性中心在高
pH
环境下转变为
R
构型的突变型酮还原酶；本专利技术还有一个目的是提供编码该突变型还原酶的基因序列，及其重组表达载体和宿主细胞；本专利技术还有一个目的是提供前述突变型酮还原酶粗酶液的制备方法；本专利技术还有一个面对是提供前述突变型酮还原酶在高
pH
环境下作为
R
构型酮还原酶上的应用，特别是针对具有
NHBoc
基团的手性中心，也可提供
R
构型产物的高效转化
。
[0004]
技术实现思路
：本专利技术提供的一种突变型酮还原酶，包含与
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列具有至少
95
％相同的氨基酸序列，更进一步地，所述突变型酮还原酶包含与
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列具有至少
98
％相同的氨基酸序列
。
[0005]其中，
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列来自中国专利申请
CN111235123A
所公开
CX
‑
LAC II
菌株，该菌株于
2020
年2月
24
日保藏于中国典型培养物保藏中心
(CGMCC)
，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号3院3号，保藏编号
NO.19432
，经鉴定为谷糠乳杆菌
(Lactobacillus farraginis)。
该菌株兼性厌氧，在
MRS
固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为
3.0mm
±
1.0mm。
显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动
。
[0006]尽管中国专利申请
CN111235123A
提供了基于
CX
‑
LAC II
菌株的突变菌株，但都不具备高
pH
耐受的特性
。
本专利技术所述的酮还原酶基于
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列具有如下突变位点：第
40
位的
H
突变为
R
，第
94
位的
F
突变为
P
，第
190
位的
Y
突变为
P。
同时包含以上三个突变位点即可实现在
pH
大于
10
的反应体系下催化具有
NHBoc
基团手性中心羰基以获得超过
99ee
％的
R
构型产物，同时也催化其他常规手性中心的羰基
。
在其基础上，可进一步在其他
位点进行改良，在保持手性纯度的前提下进一步提高转化率
。
作为一种优选方案，可将第
206
位的
N
突变为
F
，或将第
249
位的
Y
突变为
W
，或同时对这两个位点进行突变，在
pH
为
10.0
‑
10.5
的反应体系中具有不低于
80
％的转化率，最高可达
85
％
。
但当
pH
大于
10.5
时，粗酶液的转化率会显著降低
。
[0007]具体来说，所述酮还原酶具有
H40R,F94P,Y190P
三个突变位点，如
SEQ ID NO:2
所示，或所述酮还原酶具有
H40R,F94P,Y190P,N206F
四个突变位点，如
SEQ ID NO:3
所示，或所述酮还原酶具有
H40R,F94P,Y190P,Y249W
三个突变位点，如
SEQ ID NO:4
所示
。
[0008]对应地，本专利技术提供编码前述酮还原酶的基因序列，其中编码
SEQ ID NO:2
所示氨基酸序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO:5
所示，编码
SEQ ID NO:3
所示氨基酸序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO:6
所示，编码
SEQ ID NO:4
所示氨基酸序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO:7
所示
。
[0009]本专利技术进一步提供了包含前述基因序列的重组表达载体，通过构建重组表达载体，加入到感受态宿主细胞获得表达所述酮还原酶的工程菌株
。
所述表达载体选用包括但不限于
pET、pGEX、pMAL
的任意一种，优选
pET
‑
28
质粒；所述宿主细胞选用包括但不限于大肠杆菌
、
枯草芽孢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种突变型酮还原酶，其特征在于：包含与
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列具有至少
95
％相同的氨基酸序列
。2.
根据权利要求1所述的一种突变型酮还原酶，其特征在于，该酮还原酶基于
SEQ ID NO:1
所示氨基酸序列具有如下突变位点：第
40
位的
H
突变为
R
，第
94
位的
F
突变为
P
，第
190
位的
Y
突变为
P。3.
根据权利要求1所述的一种突变型酮还原酶，其特征在于：该酮还原酶为
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4
任意一条氨基酸序列
。4.
编码权利要求3所述酮还原酶的基因序列
。5.
重组表达载体，包含权利要求4所述的基因序列
。6.
宿主细胞，包含权利要求5所述的重组表达载体
。7.
一种突变型酮还原酶粗酶液的制备方法，其特征在于：通过基因工程方法获得权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫华，张利坤，谈聪，俞丽燕，钱敏帆，唐东英，华超，佘宇帆，吴自成，范艳，陈熙，唐云平，李业，田灵芝，葛文强，李淦如，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：