一种高立体选择性亚胺还原酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种高立体选择性亚胺还原酶及其制备方法和应用，通过对野生型气单胞菌进行定点突变，获得了高立体选择性的亚胺还原酶菌株。其可以用于麦斯明为底物生物催化制备(S)

【技术实现步骤摘要】
一种高立体选择性亚胺还原酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物酶催化领域，具体地说涉及一种高立体选择性亚胺还原酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]烟碱俗名尼古丁，是烟草中生物碱的主要成分。其是重要的医药、农药、香料等化工原料，并可用于生产戒烟产品、电子烟以及农药。近年发现通过烟碱受体作用于中枢神经递质系统，促进巴胺释放，对帕金森病的发病有一定预防作用，同时烟碱作为治疗心血管病、皮肤、蛇毒虫咬伤害等疾患药物的原料，需求量日益增大，特别是高纯度的烟碱，在国际市场备受欢迎。
[0003]烟碱含有一个手性中心，存在两个对映体：(S)
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烟碱和(R)
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烟碱，两者在烟草中含量、代谢机理和生理特性完全不同，天然烟草中的烟碱主要为S
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构型，化工合成的尼古丁在制备过程中由于没有进行手性拆分，因而一般为外消旋体。外消旋体与天然烟草提取物相比，50％的非精神活性(R)
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烟碱和50％的精神活性(S)
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烟碱的存在将烟油的潜在活性分成两部分。
[0004](S)
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降烟碱(式II化合物)是制备(S)
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烟碱(式III化合物)重要中间体，(S)
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降烟碱通过氨甲基化反应即可制备(S)
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烟碱，因此(S)
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降烟碱光学纯度决定(S)
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烟碱光学纯度。生物催化法具有反应操作简单、成本低、条件温和、能耗小、环境友好和产品光学纯度高等优势，因此受到越来越多的关注。手性胺的生物酶催化法常用的酶主要包括转氨酶、单胺氧化酶、脱氢酶和亚胺还原酶等。相比其他几种酶，亚胺还原酶(IRED)在环状手性胺的合成效果显著，明显优于拆分和去消旋化，适用底物范围广且反应条件温和、催化效率高、立体选择性好，是合成手性胺的重要的途径。一条有效途径寻找合适S型亚胺还原酶，将麦斯明(式I)通过亚胺还原酶催化合成(S)
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降烟碱，而此过程需消耗等量辅酶NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)供氢，转化为NADP
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(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，而辅酶NADPH价格昂贵，为了使辅酶NADPH循环，一般需用葡萄糖作为电子供体在葡萄糖脱氢酶(GDH)催化下，将葡萄糖氧化为相应的葡萄糖酸，将电子转移给NADP
+
，进而使辅酶循环。
[0005][0006]目前本领域制备高光学纯度(S)
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烟碱主要通过植物提取制备，而化学合成主要先制备外消旋烟碱，再利用化学拆分剂对其拆分获得(S)
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烟碱，例如中国专利申请“在醇化物碱存在下通过烟酸乙酯与N
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乙烯基吡咯烷酮反应制备外消旋烟碱及后续处理步骤”(公开号CN111511726A，公开日2020年08月07日)中先通过化学法用还原剂将麦斯明还原成消旋
降烟碱，再甲基化为外消旋烟碱进而利用二苯甲酰基酒石酸拆分获得手性纯度99％的左旋烟碱。化学法需要大量有机溶剂及化学拆分剂，工艺繁琐、成本高、污染大，与当今绿色化学主题相违背。中国专利申请“一种高光学纯度烟碱的制备方法”(公开号CN112409327A，公开日2021年02月26日)公布使用生物酶制备左旋烟碱，但未报到涉及底物浓度和酶投加量，且使用酶为游离酶，使酶转化液中引入较多酶蛋白杂质。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种高立体选择性S型亚胺还原酶及其表达序列，可用于将麦斯明还原为(S)
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降烟碱；本专利技术还有一个目的是提供基于前述表达序列的重组表达载体和宿主细胞；本专利技术还有一个目的是提供包含前述S型亚胺还原酶的制备方法；本专利技术还有一个目的是提供所述S型亚胺还原酶在制备(S)
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降烟碱上的应用。
[0008]技术方案：本专利技术的一种S型亚胺还原酶，其包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其编码基因序列包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。该序列的来源是基于野生型气单胞菌Aeromonas sp.FDAARGOS 1419获得的，该菌株为模式菌株，其基因组已公开于GenBank。以Aeromonas sp.FDAARGOS 1419的基因组为模版，设计一对引物，扩增获得亚胺还原酶基因ired I，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其翻译的氨基酸序列IRED I如SEQ ID No.3所示。本专利技术是通过对IRED I进行定点突变，获得IRED II，即SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。对IRED II进行密码子优化，获得对应的核苷酸序列即SEQ ID No.2。
[0009]基于上述方式获得的IRED II相较于IRED I对底物麦斯明(CAS:532
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7)具有更高立体选择性，该酶可将麦斯明还原为(S)
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降烟碱，对映体过量e.e.％>99％，尤其是通过制备成固定化酶后可耐受高浓度麦斯明底物，且酶可重复利用，具有较高工业应用价值。
[0010]本专利技术可基于定点突变后的IRED II设计重组表达载体并转染到感受态的宿主细胞，通过发酵工程获得具有高立体选择性的S型亚胺还原酶。
[0011]其中，所述S型亚胺还原酶的制备方法如下：
[0012](1)对Aeromonas sp.FDAARGOS 1419菌株的亚胺还原酶氨基酸序列IRED I进行定点突变，第57位的A突变为R，第122位的D突变为A，第176位的A突变为G，第241位的S突变为G，突变后获得如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，经密码子优化获得如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
[0013](2)构建包含SEQ ID No.2核苷酸序列的重组表达载体，加入感受态宿主细胞获得表达IRED蛋白的重组菌株；
[0014](3)将重组菌株经培养、超声破碎后获得粗酶液，用于微生物固定和/或分离纯化和/或生物催化反应。
[0015]利用前述SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，通过现有的基因工程技术，构建表达载体，然后加入感受态的宿主细胞获得相应的表达IRED蛋白菌株。
[0016]所述表达载体选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL的任意一种，优选pET
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28质粒；所述宿主细胞选用包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种，大肠杆菌细胞生长繁殖速度快且BL21(DE3)适用于高效表达外源基因，因此优选大肠杆菌作为宿主细胞。
[0017]利用上述方法制备获得的S型亚胺还原酶可以直接用于生物催化，也可用于工业
化制备(S)
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降烟碱。制备(S)
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降烟碱是以麦斯明为底物，加入所述粗酶液或其制品构建生物催化反应体系，获得高收率、高立体选择的(S)
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降烟碱。其中，所述S型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高立体选择性S型亚胺还原酶，其包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。2.编码如权利要求1所述的高立体选择性S型亚胺还原酶的基因序列，其包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。3.一种重组表达载体，其包含如权利要求2所述的基因序列。4.一种宿主细胞，其包含如权利要求3所述重组表达载体。5.一种S型亚胺还原酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)对Aeromonas sp.FDAARGOS 1419菌株的亚胺还原酶氨基酸序列IRED I进行定点突变，第57位的A突变为R，第122位的D突变为A，第176位的A突变为G，第241位的S突变为G，突变后获得如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，经密码子优化获得如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；(2)构建包含SEQ ID No.2的重组表达载体，加入感受态宿主细胞获得表达IRED蛋白的重组菌株；(3)将重组菌株经培养、超声破碎后获得粗酶液，用于微生物固定和/或分离纯化和/或生物催化反应。6.根据权利要求5所述的一种S型亚胺还原酶的制备方法，其特征在于：所述重组表达载体选自pET、pGEX、pMAL的任意一种。7.根据权利要求6所述的一种S型亚胺还原酶的制备方法，其特征在于：所述宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利坤，华超，汤必成，金力，钱敏帆，杨卫华，俞丽燕，谈聪，严燕兵，倪建洲，胡钦，吴自成，葛文强，王云，李淦如，朱国良，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：